甲殼胺抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究

趙麗艷，李明春，孫宇，馬守棟，程艷芹，曹恩惠

甲殼胺抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究

趙麗艷，李明春，孫宇，馬守棟，程艷芹，曹恩惠

【摘要】

目的研究甲殼胺對 S180 荷瘤小鼠的抗瘤作用。

方法取 S180 荷瘤小鼠 40 只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行不同劑量（50、100、200mg/(kg·d)）甲殼胺灌胃處理，對照組僅灌胃生理鹽水，連續(xù) 10 d。灌胃結(jié)束時(shí)檢測兩組小白鼠的體重變化，觀察甲殼胺對腹水瘤小鼠腹水生成的影響，解剖腹腔觀察腹水瘤生長情況，HE 染色觀察瘤細(xì)胞。

結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小白鼠體重大于對照組小鼠體重，腹水量減少，解剖結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腹水瘤塊小于對照組，三種劑量的抑瘤率分別是 17.4%、38.8% 和 41.6%。通過對細(xì)胞狀態(tài)的比較，實(shí)驗(yàn)組的瘤細(xì)胞數(shù)目減少，瘤細(xì)胞的體積小，變形、死亡細(xì)胞增多，核分裂較少見。

結(jié)論甲殼胺在體內(nèi)具有抗 S180 腹水瘤形成的作用。

【關(guān)鍵詞】抗腫瘤藥； 動物實(shí)驗(yàn)； 小鼠

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(6):419-422

甲殼胺（chitosan）是一種天然高分子多糖，也稱殼聚糖、幾丁聚糖，由氨基葡萄糖經(jīng) β-1，4-糖苷鍵連接而成，是天然多糖中唯一的堿性多糖[1-2]。甲殼胺廣泛存在于海洋生物蝦、蟹等甲殼類動物的外殼中，人類最早利用甲殼資源始于中國著名的《本草綱目》，其內(nèi)記載：“蟹殼有破淤消積的功能”。據(jù)報(bào)道，甲殼胺具有促進(jìn)凝血和傷口愈合、活化人體細(xì)胞、提高人體免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力、清除自由基、抑制癌細(xì)胞、防止癌癥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等作用[3-5]。本文通過觀察甲殼胺對 S180 荷瘤小鼠體重、腹水瘤生長情況和瘤塊細(xì)胞的變化，研究甲殼胺對 S180 荷瘤小鼠的抗瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 甲殼胺（純度 ≥ 95%，脫乙酰化率 ≥ 95%）購自青島甲殼胺生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物與瘤株 清潔級 BALB/c 純系雄性小鼠，6 周齡，體重 1923 g，購自青島市藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動物中心[合格證號 SCXK（魯）20090007]。飼養(yǎng)條件：所有實(shí)驗(yàn)動物給予食用全價(jià)顆粒飼料，12 h/12 h 光照，自由攝食飲水，溫度19 ~ 25 ℃，相對濕度 50% ~ 60%。S180 瘤株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所趙忠鵬博士提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 SW-CJ-1F 型凈化工作臺購自江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司；DODEL2300 型恒溫 CO2培養(yǎng)箱購自美國 Shell-Lab 公司；37XA 型倒置顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；DV215CD 型電子分析天平購自美國 OHAUS 公司。

1.2 方法

1.2.1 S180 瘤株細(xì)胞懸液的制備 將 S180 腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇、種植傳代，待傳代至第 6 天，腫瘤生長旺盛時(shí)，緩緩抽出約 4 ~ 5 ml 的乳白色血性液體，加入 3 倍的無菌生理鹽水稀釋，迅速離心，制成 1 ×106/ml 的細(xì)胞懸液。

1.2.2 荷瘤動物模型的制備與分組 取 S180 肉瘤細(xì)胞懸液，按 1 × 106個(gè)/ml、0.2 ml/只無菌接種至小鼠腹腔。次日隨機(jī)分為對照組（生理鹽水）、低劑量處理組（50 mg/kg）、中劑量處理組（100 mg/kg）和高劑量處理組（200 mg/kg），每組10 只。于接種 24 h 后采用灌胃處理。每日處理1 次，連續(xù) 10 d。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 小鼠行為以及體重變化 實(shí)驗(yàn)組和對照組，從實(shí)驗(yàn)開始，觀察小白鼠行為及體重變化，將實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行比較，分析各組的體重變化。

1.2.3.2 各組小白鼠腹水瘤腹水量及抑瘤率 無菌抽取腹水，比較腹水量。頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，表面血污用濾紙吸干，稱重，按下式分別計(jì)算抑瘤率，抑瘤率 =（對照組平均瘤重 － 處理組平均瘤重）/對照組平均瘤重 × 100%。

1.2.4 HE 染色比較瘤塊細(xì)胞組織形態(tài)學(xué) 取中劑量實(shí)驗(yàn)組和對照組少量 S180 瘤塊細(xì)胞，制成瘤細(xì)胞懸液，HE 染色，觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組中腹水瘤塊狀物的細(xì)胞形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表 1 實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化情況Table 1 Change of body weight of mice

表 2 甲殼胺對荷瘤小鼠 S180 腫瘤的抑制作用Table 2 Effect of chitosan on the growth of tumor in S180 mice

2 結(jié)果

2.1 甲殼胺對 S180 荷瘤小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠體重變化情況見表 1。與對照組相比，各劑量組小鼠體重均有所增加（P < 0.05）；且觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的毛色光亮、行動靈敏，明顯強(qiáng)于對照組。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠飲食情況良好，均未觀察到血尿和便血。

2.2 甲殼胺對 S180 荷瘤小鼠腹水瘤的影響

實(shí)驗(yàn)組小白鼠腹部膨隆程度比對照組膨隆程度小，剖開腹腔后，發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)臟器變化相似，如肝臟、脾臟和腎臟均有一定程度的萎縮，幅度相同；腹水較對照組少。各組小鼠腹水量、瘤重及抑瘤率結(jié)果見表 2。

結(jié)果提示，給予低劑量的甲殼胺即能顯著抑制腹水的生成（P < 0.01），隨著劑量的加大，腹水亦減少，但各劑量組間無顯著性差異（P > 0.05）。對各組的瘤體重量進(jìn)行方差分析，組間存在顯著性差異（P < 0.01）。顯示甲殼胺在劑量 50 ~ 200 mg/(kg·d)范圍內(nèi)具有抑制小鼠 S180 腹水瘤生長的作用，并且這種作用隨劑量的增加而增加。

2.3 甲殼胺對 S180 荷瘤小鼠細(xì)胞狀態(tài)的影響

HE 染色觀察實(shí)驗(yàn)組瘤塊和對照組瘤塊結(jié)果見圖 1。

圖 1 瘤塊細(xì)胞的 HE 染色結(jié)果 [A：對照組小鼠瘤塊細(xì)胞涂片 HE 染色結(jié)果（1：S180 瘤細(xì)胞；2：死亡的瘤細(xì)胞；3：處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞）；B：實(shí)驗(yàn)組小鼠瘤塊細(xì)胞涂片 HE染色結(jié)果（1：S180 瘤細(xì)胞；2：死亡的瘤細(xì)胞）]Figure 1 The HE dyeing image of tumor cell [A: The HE dyeing image of tumor cell from the control group (1: S180 tumor cell; 2: Died tumor cell; 3: Splitting tumor cell); B: The HE dyeing image of tumor cell from the treatment group (1: S180 tumor cell; 2: Died tumor cell)]

瘤細(xì)胞呈小圓形、胞漿少、核大而染色深。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對照組瘤塊的細(xì)胞成分是一樣的，但實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞的體積小，變形、死亡細(xì)胞增多，核分裂較少見，說明甲殼胺能抑制瘤細(xì)胞的生長。

3 討論

動物移植性腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法是檢測和篩選抗腫瘤藥物的通用方法[6]，本實(shí)驗(yàn)用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用 S180 肉瘤檢測甲殼胺的抗瘤活性。S180 是一種肉瘤細(xì)胞株，可在昆明鼠和其他品系的小白鼠體內(nèi)生長。腹腔接種以腹水型腫瘤生長，接種在實(shí)體組織則以瘤塊型生長，特別適合于做體內(nèi)抗瘤實(shí)驗(yàn)。

甲殼胺及其衍生物是一類陽離子型天然高分子聚合物。自 1859 年，法國人 Rouget 首先制得后，這種天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道，甲殼胺有良好的生物相容和可生物降解等特性，且本身無毒無害，具有抗菌、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等藥理作用[7-9]。我們發(fā)現(xiàn)，甲殼胺處理后的荷瘤小鼠，不僅小鼠的體重有所增加，而且甲殼胺三個(gè)劑量組均使荷瘤小鼠的腹水量減少、瘤塊重量減輕，中、高劑量組作用更明顯。表明甲殼胺可抑制 S180 荷瘤小鼠的腫瘤生長，且其抗腫瘤效應(yīng)有一定的劑量依賴性，但劑量過大，增加作用就不再明顯。通過 HE 染色觀察，發(fā)現(xiàn)甲殼胺組荷瘤小鼠瘤塊的細(xì)胞數(shù)目減少、細(xì)胞變形、體積縮小，證明甲殼胺對動物源性 S180 肉瘤細(xì)胞具有抗瘤活性。本實(shí)驗(yàn)為下一步研究利用我國豐富的海洋生物資源甲殼胺奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Ma SK, Zhou X, Lu HN, et al. Development and problems of research on chitin, chitison and their derivates. J Tianjin Med Univ, 2004, 10(Suppl):12-15. (in Chinese)馬世坤, 周旋, 路翰娜, 等. 甲殼素、甲殼胺及其衍生物的研究進(jìn)展與存在問題. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 10(增刊):12-15.

[2] Recinos G, Inaba K, Dubose J, et al. Local and systemic hemostatics in trauma: a review. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg, 2008, 14(3): 175-181.

[3] Liu QF, Ren HX, Xue WH. Effect on MCF-7 breast cancer of low molecular N-trimethyl chitosan chloride. Chin J Biochem Pharma, 2006, 27(1):35-37. (in Chinese)劉其鳳, 任慧霞, 薛偉華. 低分子季銨化殼聚糖對乳腺癌細(xì)胞作用的研究. 中國生化藥物雜志, 2006, 27(1):35-37.

[4] Yang JY, Liu JW, Liu CC, et al. Inhibitory effects of carboxymethyl-chitosan on proliferation and in vitro metastatic ability in human highly metastatic lung carcinoma 95-D Cells. Chin J Clin Pharmacol Ther, 2006, 11(6):640-643. (in Chinese)楊靖亞, 劉建文, 劉承初, 等. 羧甲基殼聚糖對人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞—95-D增殖能力和體外轉(zhuǎn)移能力的抑制作用. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2006, 11(6):640-643.

[5] Silipo A, Erbs G, Shinya T, et al. Glyco-conjugates as elicitors or suppressors of plant innate immunity. Glycobiology, 2010, 20(4):406-419.

[6] Xu SY, Bian RL, Chen X. Pharmacological experimental methodology. 3rd ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2002:1757-1779. (in Chinese)徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第三版). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2002:1757-1779.

[7] Zhou G, Sun Y, Xin H, et al. In vivo antitumor and immunomodulation activities of different molecular weight lambda-carrageenans from Chondrus ocellatus. Pharmacol Res, 2004, 50(1):47-53.

[8] Maeda Y, Kimura Y. Antitumor effects of various low-molecular-weight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma 180-bearing mice. J Nutr, 2004, 134(4):945-950.

[9] Xie Y, Zhou NJ, Gong YF, et al. The immune response induced by H pylori vaccine with chitosan as adjuvant and its relation to immune protection. World J Gastroenterol, 2007, 13(10):1547-1553.

ObjectiveTo determine the antitumor activity of the chitosan to the S180 tumor-bearing mice.

MethodsThe S180 tumor-bearing mice models were established, and were divided into chitosan groups with 3 different doses and control group. The changes of weights and the growth of solid tumors of all groups were detected, and the HE Staining of tumor cells were observed.

Results Compared with the control group, the mice weights of treatment groups increased and the weights of tumor decreased. The inhibition rate was 17.4%, 38.8% and 41.6% at the dose of 50, 100, 200 mg/kg chitosans, respectively. The number of the tumor cells of experimental group reduced. The tumor cells were small, deformed and the dead cells increased. The nuclear division rared.

ConclusionChitosan can prevent the S180 sarcoma in mice from developing.

【Key words】Antineoplastic agents; Animal experimentation; Mice

Author Affiliations:Pharmacy of the PLA 401stHospital, Qingdao 266071, China (ZHAO Li-yan, LI Ming-chun, MA Shou-dong, CHENG Yan-qin, CAO En-hui); Clinical Laboratory of the PLA 305thHospital, Beijing 100017, China (SUN Yu)

Corresponding Author:LI Ming-chun, Email: lmchun401@126.com www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):419-422

基金項(xiàng)目：全軍十一五醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（06MA094）

作者單位：266071 青島，中國人民解放軍第四零一醫(yī)院藥劑科（趙麗艷、李明春、馬守棟、程艷芹、曹恩惠）；10001 北京，中國人民解放軍第三零五醫(yī)院檢驗(yàn)科（孫宇）

通訊作者：李明春，Email：lmchun401@126.com

收稿日期：2010-09-16

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.004

Research on the antitumor activity of chitosan

ZHAO Li-yan, LI Ming-chun, SUN Yu , MA Shou-dong, CHENG Yan-qin, CAO En-hui

【Abstract】