短片段擴增KIR基因的PCR-SSP分型法的建立及其應用

譚愈昱，林健，晉溶辰，唐煒立，黃干，彭健，周智廣

·論著·

短片段擴增KIR基因的PCR-SSP分型法的建立及其應用

譚愈昱，林健，晉溶辰，唐煒立，黃干，彭健，周智廣

目的建立短片段擴增殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）基因的序列特異性引物聚合酶鏈反應（PCR-SSP）分型法。

受體，KIR； 聚合酶鏈反應； 基因

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2010, 5(3):165-170

殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobin-like receptor，KIR）基因編碼一族激活性和抑制性 KIR 受體，表達在 NK 細胞和部分 T 細胞表面，通過特異性識別靶細胞表面的MHC-I 類分子，轉導激活或抑制信號，從而調節NK 細胞和 T 細胞的活性[1]，在抗感染、腫瘤監測、移植免疫和自身免疫性疾病等方面發揮重要作用。KIR 基因具有高度多態性，目前已明確的有 16 個KIR 基因，其檢測方法主要為序列特異性引物聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）。但同一 KIR 基因及其等位基因的檢出率因所采用的特異性引物以及相應的擴增產物長度的不同而不同。擴增產物為長片段（0.5 ～ 2 kb）者，對樣本基因組 DNA 的要求高，增加 KIR 基因的漏檢率。同時，隨著 KIR 新等位基因和新座位的發現，既往的 PCR-SSP 分型方法存在漏檢和誤檢的可能。因此，本研究在 Vilches等[2]工作基礎上建立短片段擴增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法，將其與長片段擴增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法進行比較，并檢測湖南漢族人群KIR基因的分布頻率，初步評價其應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 通過流行病學調查、健康體檢等方式，在排查自身免疫性疾病、糖尿病、腫瘤等疾病史及家族史后，隨機選取 330 例湖南漢族健康志愿者，簽署知情同意書后，抽取 4 ml EDTA 抗凝全血，備用于基因組 DNA 的提取。

1.1.2 試劑與儀器 Taq DNA 聚合酶和 dNTP購自加拿大 Formentas 公司；DNA Marker 購自天根生化科技（北京）有限公司；用于提取 DNA 的飽和酚、酚-氯仿、異戊醇均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；蛋白酶 K 購自美國 Amresco公司；5 例已知基因型的標本（標本 1：KIR2DL1、KIR2DL3 和 KIR3DL1 陽性；標本 2：KIR2DL2、KIR2DS2 和 KIR3DL1 陽性；標本 3：KIR2DS4、KIR3DS1 和 KIR2DS5 陽性；標本 4：KIR2DL5陽性；標本 5：KIR2DS1 陽性）由瑞典 Karolinska學院的 Carani 教授饋贈；GelDoc2000 凝膠成像系統為美國 Bio-Rad 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA 抽提 采用苯酚-氯仿法。

1.2.2 引物合成 參照文獻[2]方法合成短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法引物（表 1），反應 1 ～ 15 的內對照引物為 PIC-F1（5’ GAGGTA ACTGTGCTCACGAACAGC 3’）和 PIC-R1（5’ GG TCCATACCCCAGTGCTTGAGAAG 3’），擴增產物長度 283 bp；反應 16 的內對照引物為 PIC-F1 和PIC-R2（5’ CACGTTCTCTGTAGTCTCTGGG 3’），擴增產物長度 608 bp。長片段擴增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法的引物參照文獻[3]。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成并經過 Blast 驗證。

1.2.3 KIR 基因 PCR-SSP 分型 各 KIR 基因均采用 2 ～ 3 條 KIR 基因上下游引物加一對內對照引物體系。

⑴短片段擴增 KIR 基因：PCR-SSP 反應總體系 10 μl，含 10 × PCR 緩沖液 1 μl、dNTP 終濃度0.2 mmol/L、MgCl21.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶0.5 U、各 KIR 引物終濃度 0.5 ～ 2.5 μmol/L、內對照引物終濃度 0.1 μmol/L、模板 DNA 終濃度為10 ng/μl。PCR 循環條件：95 ℃ 預變性 2 min；94 ℃ 變性 10 s，65 ℃ 退火 40 s，共 10 個循環；94 ℃ 變性 20 s，61 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 20 個循環。

⑵長片段擴增 KIR 基因：PCR-SSP 反應體系及循環條件參照文獻[3]方法進行。

1.2.4 KIR 基因型的判定 所有 PCR 擴增產物均行 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后于 GelDoc2000 凝膠成像系統上分析結果。內對照條帶及目的基因條帶均出現者，相應的 KIR 基因為陽性；僅出現內對照條帶者相應的 KIR 基因為陰性；內對照條帶未出現者無論目的基因條帶出現與否都需重新擴增。

1.2.5 質量控制 采用 5 例已知基因型的標本作為陽性質控，且同時設立陰性對照和空白對照。所有結果為陰性的標本或長片段與短片段擴增KIR 基因結果不一致的標本均重新擴增 1 ～ 2 次，判讀結果。

1.3 統計學處理

KIR 基因出現頻率（f），即 KIR 基因的陽性率通過直接計數法計算，計算公式為：f = 基因陽性例數/檢測總例數；KIR 基因頻率（gene frequency，GF）的計算公式為：GF = 1 –（1 – f）1/2。2 種分型方法對 KIR基因檢測陽性率的比較采用 SPSS 13.0 統計軟件四格表 χ2檢驗公式計算，當 1 ≤理論頻數 ＜ 5 時，使用連續性校正，以 P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

表 1 短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法引物Table 1 Primers used for KIR genotyping by PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments

2 結果

2.1 短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法的建立

本實驗所建立的 PCR-SSP 分型法，在湖南漢族人群中可檢測出目前已知的 16 個 KIR 基因，其中 KIR2DS4 基因檢測可區分至 KIR2DS4*001（133 bp）、KIR2DS4*003/004/006/007（111 bp）及KIR2DS4 雜合子，所有 KIR 基因擴增產物電泳后條帶清晰（圖 1），與已知基因型的陽性質控標本結果判斷一致。

2.2 短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法的應用

應用短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法檢測 330 例湖南漢族健康志愿者的 DNA 標本，其中 KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1基因的陽性率均為 100%；KIR2DL1、KIR2DL3、 KIR3DL1、KIR2DS4、KIR2DP1 基因的陽性率較高，分別為 96.4%、96.1%、94.2%、94.2%、99.7%；其次 KIR2DL2、KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1 基因的陽性率均 ＜40%（表 2）。另外，KIR2DS4*001、KIR2DS4*003/ 004/006/007 及 KIR2DS4 雜合子的陽性率分別為46.1%（152/330）、19.4%（64/330）、28.8%（95/330）。

2.3 長、短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法的比較

從 330 例湖南漢族健康志愿者的 DNA 標本中隨機選取 100 例用于長、短片段擴增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法的比較。長、短片段擴增 KIR基因的 PCR-SSP 分型法（長、短片段方法）均可檢測出目前已知的 16 個 KIR 基因，但對同一基因的檢測陽性率存在差異，將 2 種分型方法檢測結果不一致的標本經重復擴增驗證后結果如表 3、表 4。2 種分型方法檢測 KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1 基因的陽性率一致，但長片段方法檢測其余 KIR 基因的陽性率均低于短片段方法，即存在一定的漏檢，其中長、短片段方法檢測 KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1 基因的陽性率差異具有統計學意義（P ＜0.05），并以 KIR2DS4 基因差異最為顯著（62% vs.94%，P ＜ 0.001）。同時，長片段方法對 KIR2DS2、KIR2DS4 基因各有 1 例誤檢。

圖 1 短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法擴增結果Figure 1 The results of KIR genotyping by PCR-SSP that amplified short DNA fragments

表 2 短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法檢測 330 例湖南漢族健康人群的基因頻率分布Table 2 The distribution of KIR gene frequencies detected by PCR-SSP that amplified short DNA fragments in 330 healthy population of Hunan Han

短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法檢測 KIR2DS4 基因的 3 類等位基因的陽性率分別為：KIR2DS4*001（41%）、KIR2DS4*003/004/006/ 007（34%）和 KIR2DS4 雜合子（19%）；而長片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法不能區分KIR2DS4 等位基因。

表 3 長（L）、短（S）片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法的比較Table 3 The positive rate of KIR genes by PCR-SSP method that amplifies long (L) and short (S) DNA fragments

表 4 長（L）、短（S）片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法檢測結果的差異性分布Table 4 The differences in the distribution of KIR genes results by PCR-SSP method that amplifies long (L) and short (S) DNA fragments

3 討論

KIR 基因屬于常染色體共顯性遺傳，位于人類染色體 19q13.42，長約 100 ～ 200 kb，具有高度多態性。已明確的 KIR 基因共 16 個，包括 14 個功能基因（KIR2DL1-5、KIR3DL1-3、KIR2DS1-5、KIR3DS1）和 2 個假基因（KIR2DP1、KIR3DP1），形成以 KIR3DL2 和 KIR3DL3 基因分列染色體端粒端和著絲粒端，KIR2DL4 和 KIR3DP1 基因居中的框架格局，各 KIR 基因的規律組合又可形成 KIR 基因 A 和 B 兩種單倍型[4]。KIR 基因表達產物—— KIR 受體對 NK 細胞和部分 T 細胞活性調節起著重要作用，故檢測 KIR 基因對感染、腫瘤和自身免疫病發病機制探討、發病預測、治療及造血干細胞移植具有臨床指導意義。

1997 年 Uhrberg 等[5]首次建立 PCR-SSP 方法檢測 KIR 基因。其后的研究者在改良 PCR-SSP方法的同時，探索多重 PCR-SSP、序列特異性寡核苷酸探針聚合酶鏈反應（PCR-SSOP）、RT-PCR 等檢測法[6-8]。但這些方法都存在一定的局限性，主要表現在 PCR-SSOP 與 RT-PCR 方法需要特定的儀器，且試劑、耗材較貴；而 PCR-SSP 方法雖簡單易行、經濟，但因其既往所采用的引物不能檢測出近年新發現的 KIR 基因的等位基因和座位，且擴增產物多為長片段，對樣本基因組 DNA 要求高，存在漏檢和誤檢的可能。為此，我們在 Vilches等[2]前期工作基礎上建立短片段擴增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法。本研究顯示，該分型法準確可行，與長片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法相比，其對 KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1基因漏檢率和誤檢率明顯降低，且可在同一 PCR反應管內檢測 KIR2DS4*001、KIR2DS4*003/004/ 006/007 及 KIR2DS4 雜合子。

KIR2DS4 基因是 KIR 基因單倍型 A 的成員之一，編碼激活性 KIR2DS4 受體。研究報道其與成人隱匿性自身免疫糖尿病、丙型肝炎、慢性粒細胞白血病、非白血性白血病、類風濕性關節炎等疾病密切相關[9-13]。在 KIR2DS4 等位基因中，只有KIR2DS4*001 具有正常結構，其他等位基因均因有長約 22 bp 片段的缺失（缺失型）使外顯子 5 讀碼框移位，而不能起到激活膜受體的功能[14]。這兩類等位基因在人群中的分布不均，高加索人群以缺失型等位基因為主，而亞洲和非洲等人群則以KIR2DS4*001 為主[15]。本研究發現中國湖南漢族健康人群中 KIR2DS4 基因頻率為 94.2%，其等位基因中 KIR2DS4*001 為 46.1%、KIR2DS4*003/ 004/006/007（缺失型）為 19.4%、KIR2DS4 雜合型為 28.8%，為進一步研究 KIR2DS4 基因在以上疾病發病機制中的作用提供了線索。

基因遺傳背景與種族、地區、疾病等因素相關。明確某一種族、某一地區健康人群 KIR 基因的分布情況，是研究該種族和地區人群 KIR 基因與疾病關系的基礎。本研究在國內外首次大樣本量檢測了中國湖南漢族健康人群中 KIR 基因的分布頻率。結果發現 KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3 和KIR3DP1 基因的檢出率均為 100%，與國內外其他人群報道一致[16-21]，也符合這 4 個基因為結構性基因的特性。KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DS4 和 KIR2DP1 基因頻率均高于 90%，而KIR2DL2、KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1 基因頻率均低于40%。KIR 基因在中國湖南漢族健康人群中的分布頻率與國內其他地區漢族人群（上海、浙江等）以及日本人群相似[16-18]，而與高加索人群差別較大，其中 KIR2DL2、KIR2DS2、KIR2DS3 基因頻率低于高加索人群，而 KIR2DL3 基因頻率高于高加索人群[19-21]。關于湖南漢族健康人群 KIR 基因型、單倍型的分布和 KIR 基因連鎖不平衡問題，我們將在下一步研究中進一步分析。

綜上所述，短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP分型法相對簡單、易行、準確，為進一步探討 KIR基因在不同種族健康人群中的差異，以及研究其遺傳背景對疾病和造血干細胞移植的影響有著重要的理論意義和實踐價值。

志謝 感謝中南大學湘雅醫學院免疫學教研室田偉教授給予的幫助和指導

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PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments for KIR gene

TAN Yu-yu, LIN Jian, JIN Rong-chen, TANG Wei-li, HUANG Gan, PENG Jian, ZHOU Zhi-guang

ObjectiveTo establish a polymerase chain reaction-sequence specific primer (PCR-SSP) method that amplifies short DNA fragments for killer cell immunoglobin-like receptor (KIR) gene.MethodsBlood samples were obtained for DNA extraction from 330 healthy volunteers of Hunan Han. The specific primers that amplified short DNA fragments of KIR genes were synthesized and 16 KIR genes were genotyping by PCR-SSP method, and analyzing the distribution of KIR gene frequencies in Hunan Han population. Then 100 samples were randomly selected from the 330 DNA samples for comparing the positive rates of KIR genes between the PCR-SSP methods that amplified long and short DNA fragments.Results①The PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments could detect all KIR genes. The PCR products showed clear strips; ②In the healthy Hunan Han population, the positive rates of KIR2DL4, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR3DP1 genes were all 100%, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR2DS4, KIR2DP1 genes were with high positive rates as 96.4%, 96.1%, 94.2%, 94.2%, 99.7%, respectively. The positive rates of KIR2DS1, KIR2DL5, KIR3DS1, KIR2DL2, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5 genes were all lower than 40%; ③The PCR-SSP methods that amplified long and short DNA fragments (the long/short fragments method) could both detect 16 KIR genes and presented consistent positive rates in KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1, while low positive rates in other KIR genes by the long fragments method. Compared with the long fragments method, the positive rates of KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1 genes by the short fragments method were improved (94% vs. 84%、40% vs. 26%、94% vs. 62%、38% vs. 20% respectively, all P ＜ 0.05), and the misdiagnosis rate and the rate of miss diagnosis were cut down by the short fragments method.ConclusionThe PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments is simple, feasible, accurate and practical, and has a good value.

Receptors, KIR; Polymerase chain reactionr; Gene

ZHOU Zhi-guang, Email: zhouzg@hotmail.com www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(3):165-170

歐洲糖尿病研究基金（EFSD 2008）；國家重點基礎研究發展計劃（973 計劃）（2006CB503901）；國家高技術研究發展計劃（863 計劃）（2006AA02A409）；湖南省高校科技創新團隊項目（2008）

410011 長沙，中南大學湘雅二醫院代謝內分泌研究所/中南大學糖尿病中心/中南大學代謝綜合征研究中心

周智廣，Email：zhouzg@hotmail.com

2010-02-02

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.001

方法選取 330 例湖南漢族健康志愿者血液標本，提取基因組 DNA；合成短片段擴增 KIR 基因的序列特異性引物，采用 PCR-SSP 分型法擴增已知的 16 個 KIR 基因，分析湖南漢族人群KIR基因的頻率分布特征。從 330 例 DNA標本中隨機選取 100 例，比較長、短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法檢測基因的陽性率差異。

結果①短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法可檢測出所有 KIR 基因，擴增產物條帶清晰，結果準確；②湖南漢族健康人群 KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1基因陽性率均為 100%，KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DS4、KIR2DP1 基因陽性率分別為 96.4%、96.1%、94.2%、94.2% 和 99.7%，而 KIR2DS1、KIR2DL5、KIR3DS1、KIR2DL2、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5 基因陽性率均＜ 40%；③長、短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法（長、短片段方法）均可檢測出 16個 KIR基因，且KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1 基因的陽性率一致，但長片段方法檢測其余 KIR 基因的陽性率均低于短片段方法，其中短片段方法檢測 KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1 基因陽性率均明顯高于長片段方法（分別為 94% vs. 84%、40% vs. 26%、94% vs. 62%、38% vs. 20%，均 P ＜ 0.05），同時漏檢和誤檢降低。

結論短片段擴增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法簡單、易行、準確，具有良好的應用價值。

Author Affiliation: Institute of Metabolism and Endocrinology, Diabetic Center, Metabolic Syndrome Research Center, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China