海藻糖合酶的作用和特點

王 寧

(沈陽師范大學,遼寧,沈陽,110034)

1 海藻糖合酶的作用機制

由于尚未得到海藻糖合酶的蛋白晶體結構,目前對海藻糖合酶作用機制的研究僅僅局限于理論推測階段。日本的科學家首先證明了海藻糖合酶的催化反應是分子內的重排過程,而不是分子之間的反應。他們利用麥芽糖作為底物,并同時在反應體系中加入 14C標記的葡萄糖,試驗結果顯示,并沒有具有放射性的海藻糖或麥芽糖的生成。隨后,韓國的科學家通過電噴霧質譜法進一步證明了這點。據報道,海藻糖合酶氨基酸序列的比對分析發現,海藻糖合酶具有α-淀粉酶家族酶類所具有的四個保守區:分別是 I XDXXXNH,II GXRXDXXZZ,IIIXXX(G/A)EZZZ, IV XXBBHD(X為疏水性氨基酸殘基,B為親水性氨基酸殘基,Z為影響酶反應特異性的氨基酸殘基)。據此推測,海藻糖合酶是α-淀粉酶家族成員之一。屬于α-淀粉酶家族的酶類具有相似的催化機制,在 II區和 III區中存在酶催化反應的活性中心:III區中的 Glu為質子供體,將一個質子傳遞給底物 1,4-糖苷鍵中的 O原子;II區的 Asp為親核試劑,攻擊底物糖分子中的異頭中心碳原子,使 C1-O鍵斷裂。而 I區和 IV區中的 His介導底物和酶分子的結合根據α-淀粉酶家族酶類的催化機制,研究人員推測海藻糖合酶通過催化兩次取代反應完成麥芽糖和海藻糖的相互轉變過程。首先,麥芽糖分子與酶的催化部位相結合,酶活性中心的 Glu將一個質子傳遞給1,4-糖苷鍵中的 O原子,與此同時 Asp攻擊 C1-O-C4中的 C1原子,形成鹽離子的過渡態。從而發生第一次取代反應,使麥芽糖分子中 C1-O鍵的斷裂,產生β-葡糖基 -酶的中間體。在此之后,酶的構象會發生變化,使得另一個游離的葡萄糖分子的相對位置發生改變,其 C1-OH正好能夠親核攻擊葡萄糖基 -酶中間體上的 C1原子,發生第二次取代反應,產生α,α-1,1-海藻糖。某些海藻糖合酶,將麥芽糖轉化為α,α-海藻糖的同時還會有少量的α,β-海藻糖(約 3%)生成,這說明在β-葡糖基 -酶的中間體形成后,酶分子可以改變為另一種構象,使得游離的葡萄糖分子在酶活中心內部以另一種空間位置發生第二次取代反應。如果水分子進入酶活中心,并作為親核試劑優先攻擊β-葡糖基 -酶的中間體上的碳原子,則會形成副產物葡萄糖,即發生雙糖的水解。通過定點突變的方法將紅色亞棲熱菌的海藻糖合酶分子中的催化位點 Glu和 Asp突變為丙氨酸,結果顯示突變酶幾乎沒有活性,證明了這些位點對酶活的重要性。海藻糖合酶催化麥芽糖和海藻糖相互轉化的可逆反應,麥芽糖和海藻糖都可以作為海藻糖合酶的底物。

2 嗜熱菌海藻糖合酶的結構特點

嗜熱菌的海藻糖合酶具有較高的最適反應溫度和很強的熱穩定性,其蛋白的分子量也較其他細菌中的海藻糖合酶大很多,嗜熱菌的海藻糖合酶比其他海藻糖合酶具有一個多余的 C端結構域。科學家也通過實驗證明了這種 C端結構域能夠增加海藻糖合酶的熱穩定性,并降低反應中副產物葡萄糖的生成。通過對嗜熱棲熱菌海藻糖合酶的 C端結構域缺失體酶活性質的研究,發現 C端結構域的缺失不會影響酶的活性,但是酶的最適溫度和熱穩定性都有所降低。而將耐放射異球菌的海藻糖合酶與該 C端結構域的融合表達后,酶的最適溫度和穩定性都被顯著提高了。此外,C端結構域可以使酶的構象發生一定程度的變化,產生更為牢固緊密的構象,使得水分子難以進入活性中心,從而降低了副產物葡萄糖的生成。

3 海藻糖合酶在生物體內起到的作用

通過對已經純化或異源表達的海藻糖合酶特性的研究,發現在細胞體外海藻糖合酶的可逆反應是向著有利于生成海藻糖的方向進行的,那么細胞體內的情況是否也如此呢?隨著對海藻糖合成途徑研究的深入,發現某些細菌體內具有兩條或 3條海藻糖合成途徑。通過實驗發現,在高滲、超氧和酸性等外界環境壓力下,TPS和 TPP蛋白的合成水平明顯提高,而 TreS蛋白的合成量沒有變化或略有降低。這說明在外界壓力下,海藻糖主要是由 TPS/TPP途徑合成,而 TreS的作用是將細胞內積累的大量的海藻糖轉化為麥芽糖。在麥芽糖葡糖基轉移酶的作用下,麥芽糖被合成為麥芽寡糖基多糖,并釋放出葡萄糖。葡萄糖被磷酸化后進入糖酵解途徑。研究結果說明大量的海藻糖對細菌的生長有一定的毒性作用,因此海藻糖的分解代謝對細胞的生長具有非常重要的作用

4 結語

雖然尚未得到海藻糖合酶的蛋白晶體結構,對其催化機制的研究只限于理論推測水平。可是隨著蛋白結晶技術的發展,相信在不久的將來我們會得到海藻糖合酶的蛋白晶體結構,并對其催化機制作出更深入的解釋。海藻糖合酶已經被廣泛應用于海藻糖的工業生產,并大大降低了海藻糖生產的成本,但如何進一步提高海藻糖合酶的酶活力和轉化率仍然是目前研究的熱點。利用生物信息學的知識,通過飽和突變或定點突變技術對海藻糖合酶基因進行遺傳學改造,改變酶活性中心附近以及與熱穩定性相關的氨基酸序列,極有可能獲得酶活更高和穩定性更高的海藻糖合酶。

[1]韋宇拓,黃日波,蒙健宗,等.谷氨酸棒桿菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法.中國:200410013006.9.2005.

[2]韋宇拓,黃日波,蒙健宗,等.耐放射性異常球菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法.中國:200410013008.8.2005.