混合菌群糖化纖維素的影響因素研究

賀月林，郭照輝，譚周進(jìn)

（1.湖南省微生物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

纖維素是植物組織的基本成分，也是綠色植物光合作用的主要產(chǎn)物，它的含量約占植物總量的一半，是地球上既豐富又不斷再生的有機(jī)物質(zhì)[1]。隨著人們的生活水平的提高，纖維素類(lèi)物質(zhì)開(kāi)始廣泛的應(yīng)用，以纖維素類(lèi)物質(zhì)為主的有機(jī)廢棄物也就日益增多。因此，纖維素分解的研究對(duì)減輕廢棄物給環(huán)境的壓力以及纖維素資源的開(kāi)發(fā)和利用有重要的意義。目前，對(duì)纖維素的降解利用主要采用生物手段，即利用纖維素分解菌或其產(chǎn)生的酶來(lái)降解纖維素[2]，因此，分離和篩選纖維素分解菌的工作尤為重要。產(chǎn)纖維素酶的微生物包括真菌、細(xì)菌和放線(xiàn)菌。其中主要有：康氏木霉（Trichoder-makoningii）、黑曲霉（Aspergillusniger）、斜臥青霉（Penicillium decumbens）、芽孢桿菌（Bacillussp.）等，而分解纖維素的細(xì)菌又包括好氧性細(xì)菌和厭氧性細(xì)菌。在還田秸稈的生物腐熟劑中，好氧性細(xì)菌制劑的施用可能會(huì)導(dǎo)致土壤還原性有害物質(zhì)產(chǎn)生，對(duì)環(huán)境和作物都產(chǎn)生不利的影響；而厭氧性細(xì)菌制劑的施用，則可能會(huì)避免由此而產(chǎn)生的有害影響[3]。筆者在研究了國(guó)內(nèi)外的研究動(dòng)態(tài)之后，從不同生態(tài)環(huán)境下的土壤中選育出分解濾紙效果較好的好氧性纖維素分解菌與厭氧性纖維素分解菌，試圖利用厭氧性細(xì)菌與好氧性細(xì)菌一起制成秸稈腐熟劑，充分利用好氧性細(xì)菌繁殖快和厭氧性細(xì)菌耗氧低或不耗氧的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料 供試材料為湖南省微生物研究所附近不同生態(tài)環(huán)境下有機(jī)質(zhì)含量較高的土壤，分別采自畜牧場(chǎng)、淤水溝、大田、魚(yú)塘、菜地等地方，共40份采樣。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）好氧性纖維素分解菌（改良查氏培養(yǎng)基）[4]：NaNO31 g， (NH4)2SO41 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，CMC-Na 1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.4，瓊脂20 g；（2）厭氧性纖維素分解菌培養(yǎng)基[4]：KNO31 g，NH4H2PO41 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·6H2O 0.3 g，CaCO35 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蛋白胨1 g，H2O 1 000mL，無(wú)淀粉濾紙條。

1.2 方 法

1.2.1 纖維素分解菌的分離培養(yǎng) （1）好氧性纖維素分解菌:采用稀釋平板分離法[4]，將改良查氏培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，搖勻，置桌面冷凝成平板，取不同土樣放入無(wú)菌水中，搖勻，制成土壤稀釋液。將土壤稀釋液上清液0.1mL滴入平板中，用無(wú)菌涂棒使其分布均勻，在37℃下培養(yǎng)2～3 d，將纖維素分解菌進(jìn)一步純化在斜面上保存。（2）厭氧性纖維素分解菌:用帶無(wú)淀粉濾紙條的厭氧性纖維素分解菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。濾紙剪成4 cm×1 cm的長(zhǎng)條狀，厭氧性纖維素分解菌培養(yǎng)基15mL裝入30mL的大試管中，將1 g土樣和濾紙條裝入試管，用棉花塞封口，37℃培養(yǎng)7～14 d，將濾紙條溶解的樣品進(jìn)一步富集，保存。

1.2.2 搖床培養(yǎng) （1）挑選保存的好氧性纖維素分解菌2環(huán)到裝有100 mL改良查氏液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，37℃培養(yǎng)36 h。（2）取保存的厭氧性纖維素分解菌5 mL到裝有厭氧性纖維素分解菌培養(yǎng)基500mL的密封鹽水瓶中，保持其較好的氣密性，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，37℃搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.3 酶活力測(cè)定 用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定纖維素CMC酶活[5]。取搖床培養(yǎng)后生成的酶液10 mL，2 000 r/min離心5 min，取上清液0.2 mL與CMC-Na 1.8 mL混合，在50℃下恒溫水浴30min，以沸水中加熱5 min滅活酶液做對(duì)照，還原糖用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定。以每毫升酶液在30min所產(chǎn)生的葡萄糖毫克數(shù)定義為一個(gè)酶活單位。

1.2.4 底物對(duì)纖維素酶活性的影響 將有纖維素酶活性的好氧性纖維素分解菌與厭氧性纖維素分解菌同時(shí)分別接種在含CMC-Na、稻草粉和濾紙的改良查氏培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，測(cè)定酶活，進(jìn)行比較。

1.2.5 尿素對(duì)纖維素酶活性的影響 將有酶活性的好氧性纖維素分解菌與厭氧性纖維素分解菌同時(shí)接種在以尿素做N源的改良查氏培養(yǎng)基中，并改變其用量，搖床培養(yǎng)，測(cè)定酶活，進(jìn)行比較。

1.2.6 磷酸鹽的用量對(duì)纖維素酶活性的影響 將有酶活性的好氧性纖維素分解菌與厭氧性纖維素分解菌同時(shí)接種在不同P源用量的改良查氏培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，測(cè)定酶活，進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的培養(yǎng)特征

好氧性纖維素分解菌在37℃下培養(yǎng)2～3 d后，平板上出現(xiàn)乳白色粘液，透明圈邊緣整齊，直徑約1.0～5.0mm，最后出現(xiàn)黃色圓斑，將細(xì)菌純化，挑選單菌落斜面保存，得到20種不同土壤來(lái)源的菌株；厭氧性纖維素分解菌在37℃下培養(yǎng)7～14 d后，試管中濾紙軟化，表面成絮狀，最后斷裂、完全崩解，保存有上述特征的土壤樣品液。

2.2 纖維素分解菌產(chǎn)酶活性的測(cè)定

經(jīng)過(guò)初步篩選，得到20種土壤產(chǎn)生的纖維素分解菌，將這些菌種保存，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，測(cè)定酶活，得到7種酶活較高的好氧性纖維素分解菌和6種厭氧性纖維素分解菌，7種好氧性纖維素分解菌A 至 G 產(chǎn)酶活性分別為 54.27、37.00、40.50、47.40、63.20、42.40、26.97 U/mL，6 種厭氧性纖維素分解菌a 至 f產(chǎn)酶活性分別為 93.02、48.24、72.35、77.52、68.91、79.24 U/mL。

2.3 好氧性纖維素分解菌與厭氧性纖維素分解菌之間產(chǎn)酶的影響

鑒于好氧性纖維素分解菌和厭氧性纖維素分解菌產(chǎn)酶時(shí)的相互影響，將纖維素酶活性較強(qiáng)的厭氧性纖維素分解菌a與好氧性纖維素分解菌A按1.2.2中（2）的搖床方法進(jìn)行搖床培養(yǎng)，測(cè)得酶活為79.24 U/mL。此結(jié)果說(shuō)明了厭氧性纖維素分解菌與好氧性纖維素分解菌在產(chǎn)酶時(shí)沒(méi)有受到相互抑制。

2.4 底物對(duì)纖維素酶活性的影響

用菌株A與菌液a混合培養(yǎng)測(cè)定以稻草粉為底物產(chǎn)生的酶活為41.3 U/mL，以CMC-Na為底物產(chǎn)生的酶活為54.3 U/mL，以濾紙為底物產(chǎn)生的酶活為20.6 U/mL，經(jīng)比較不同底物對(duì)纖維素酶活性的影響，得到以CMC-Na為底物產(chǎn)生的酶活最大，稻草粉次之，濾紙最小。

2.5 尿素對(duì)纖維素酶活性的影響

用菌株A與菌液a混合培養(yǎng)測(cè)定在不同尿素含量下的酶活。當(dāng)N源用量為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%時(shí)，菌株產(chǎn)生的纖維素酶活分別為41.34、34.45、22.40、17.24、10.33 U/m L。這說(shuō)明使用0.1%尿素做N源時(shí)所產(chǎn)生的纖維素酶活性最高，此后隨著N的含量的不斷增加，酶活性減小。

2.6 磷酸鹽對(duì)纖維素酶活性的影響

用菌株A與菌液a混合培養(yǎng)測(cè)定在不同磷酸鹽含量下的纖維素酶活。當(dāng)磷酸鹽用量為0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%時(shí)，菌株產(chǎn)生的纖維素酶活分別為 28.5、33.5、44.8、59.2、61.4 U/m L。這表明隨著磷酸鹽的含量不斷增加，酶活性有增加的趨勢(shì)；但其含量從0.2%增加到0.5%時(shí)，纖維素酶的活力增加不大。

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)推行將秸稈直接還田。在配合秸稈還田的制劑方面，日本的酵素菌、EM，國(guó)內(nèi)的腐稈靈，其腐熟效果都不佳，特別是在腐解速度上。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外研究者為了加快腐解速度，研制了一些促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的產(chǎn)品，雖然取得了一定的效果，但是還田秸稈在快速腐解的過(guò)程中，產(chǎn)生了大量的還原物質(zhì)，對(duì)作物有較大的毒害作用，影響作物的生長(zhǎng)，還加大了還原性有害氣體的產(chǎn)生，如甲烷、NO、N2O等，造成溫室效應(yīng)。這是由于目前國(guó)內(nèi)使用的微生物主要為好氧性的，在分解秸稈的過(guò)程中，要消耗大量的氧氣。日本已經(jīng)生產(chǎn)了一種厭氧性微生物制劑，既可以促進(jìn)秸稈的較快腐解，又可以減少對(duì)作物的損害。應(yīng)用資料顯示，該制劑能夠促進(jìn)秸稈腐熟，提高作物抗逆與抗病蟲(chóng)害的能力，使作物早生早發(fā)、耐倒伏，改善土壤結(jié)構(gòu)等等。因此，從事厭氧性纖維素分解微生物制劑的研發(fā)，在理論上和實(shí)踐中都是可行的。本研究篩選到一種能夠在好氧性與厭氧性條件下共同使用的纖維素腐解制劑生產(chǎn)組合菌，并且對(duì)纖維素分解菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究，為相關(guān)制劑的研制與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。其中的好氧性纖維素分解菌能夠快速分解纖維素，造成局部厭氧性環(huán)境，促進(jìn)厭氧性纖維素分解細(xì)菌的作用，減少還原性有害物質(zhì)的生成。有關(guān)該制劑的進(jìn)一步研究與應(yīng)用還有待于深入進(jìn)行。

[1] 張秀紅，張彩琴，張如云，等.高活性纖維素分解菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究[J].山西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，16（3）：56-60.

[2] 許修宏，肖玉珍，李 杰.高效纖維素分解菌篩選的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，29（4）:23-24.

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[4] 李阜棣，喻子牛，何紹江.農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[5] 北京大學(xué)生物系生物化學(xué)教研室.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) [M].北京：人民教育出版社，1980.22-24.