甲胎蛋白異質(zhì)體和甲胎蛋白信使核糖核酸用于診斷肝細(xì)胞癌

韓 風(fēng) 邱大鵬 陳偉瑜 張 玲 韓有志

(河南省腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科,河南鄭州 450003)

肝細(xì)胞肝癌(HCC)是一種惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差、侵襲性強(qiáng)的惡性腫瘤,在我國發(fā)病率有增高趨勢(shì)。雖然甲胎蛋白(AFP)是診斷HCC的重要指標(biāo),但仍有30%～40%的HCC患者AFP陰性,且其對(duì)肝癌的敏感性、特異性不高,因此尋找更特異、敏感的腫瘤標(biāo)志物和診斷方法就成為肝癌診治領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一[1]。目前檢測單個(gè)腫瘤標(biāo)志物的敏感性和特異性都不能達(dá)到滿意的程度,而多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測則可以提高檢測的靈敏度和特異度。本研究探討甲胎蛋白(AFP)異質(zhì)體(AFP-L3)和AFPmRNA聯(lián)合檢測診斷HCC的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 112份血清標(biāo)本取自本院2005年4月—2005年7月部分住院患者血清資料庫,患者年齡29～77歲,平均年齡 47.16±3.5歲;男性76例,女性36例,其中肝硬化合并門脈高壓(LC)11例、肝臟良性病變 19例(血管瘤12例,炎性假瘤2例,灶性結(jié)節(jié)性增生3例,血管平滑肌脂肪瘤2例),HCC 82例。所有病例均有術(shù)后病理學(xué)診斷。

1.2 試劑和儀器 USCNLIFE SCIENCE人小扁豆素結(jié)合型甲胎蛋白、甲胎蛋白異質(zhì)體3(AFP-L3)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢中美科技有限公司提供);BIO-RAD M680酶標(biāo)儀;引物和探針(鄭州久是生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成);Himac CR 21G低溫高速離心機(jī);HH-42三用恒溫水箱;MS1 Minishkaer IKA渦旋混合器;Biometra TGRADIENT梯度PCR儀;LightCycler 1.5 ROCHE 熒光定量PCR儀;AFP酶連試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司提供]。

1.3 方法

1.3.1 患者入院后術(shù)前、術(shù)后1個(gè)月清晨分別抽取空腹靜脈血5 mL,迅速分離血清(血細(xì)胞備用),-80℃貯存?zhèn)錅y,測定前取出標(biāo)本,待自然復(fù)融后檢測血清中AFP,AFP-L3水平。采用人小扁豆素結(jié)合型甲胎蛋白、甲胎蛋白異質(zhì)體3(AFP-L3)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定AFP、AFP-L3的含量,并計(jì)算AFP-L3占AFP總量的百分比,以AFP-L3(%)大于15%作為AFP-L3異常升高標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)用常規(guī)密度梯度離心法分離外周血有核細(xì)胞。總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,于紫外分光光度計(jì)上定量,用Primescript試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)定量。上游引物:5′-GTAAACCCTGGTCTTGGCC-3′;下 游 引物:5′-TCAGAGAATGCAGGAGGGAC-3′,擴(kuò)增最終片段長 282 bp;熒光探針:5′-TTCATATGCCAACAGGAGGCCATGC-3′。內(nèi)參為 GADPH,上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物 :5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′,產(chǎn)物為450 bp。第1輪 PCR,反應(yīng)體系為 50μL。取cDNA 5.0μL,1 0 ×PCR buffer 5.0μL,25 mmol?L-1MgCl2 3.0 μL,10 mmol?L-1d NTP 1.0μL,第1輪PCR上、下游外引物各7.5 pmol,Taq DNA聚合酶2.0 U,加滅菌水至50μL。反應(yīng)參數(shù):94℃5 min 預(yù)變性/94℃45 s、55℃45 s、72 ℃45 s、30 個(gè)循環(huán)72℃5 min延伸。第2輪PCR取第1輪PCR產(chǎn)物5μL作模板,加入7.5 pmol上下游內(nèi)引物,余反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同前。同時(shí)進(jìn)行內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增。最后繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品和內(nèi)參的Ct值,兩者相比即得相對(duì)量的表達(dá)。每次RT-PCR實(shí)驗(yàn)均以分泌AFP的肝癌細(xì)胞系HepG2為陽性對(duì)照,陰性對(duì)照則以水取代cDNA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組均數(shù)之間的比較采用t檢驗(yàn),各組之間陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)前兩組腫瘤指標(biāo)的檢測結(jié)果 見表1、表2和表3。

表1 AFP檢測與AFP-L3、AFPmRNA聯(lián)合檢測結(jié)果比較[例(%)]

表2 AFP-L3檢測與AFP-L3、AFPmRNA聯(lián)合檢測結(jié)果比較[例(%)]

表3 AFPmRNA檢測與AFP-L3、AFPmRNA聯(lián)合檢測結(jié)果比較[例(%)]

3 討 論

雖然AFP作為肝細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)沿用多年,但其敏感性和特異性均不高。1970年,Purves等[2]首先應(yīng)用淀粉凝膠電泳分離出人的AFP異質(zhì)體,其中AFP-L3則由肝癌細(xì)胞特異合成,與血AFP濃度間無明顯關(guān)系。后來的研究[3]發(fā)現(xiàn),AFP-L3對(duì)HCC的診斷、治療效果判斷及復(fù)發(fā)的預(yù)測均有意義,且較AFP更加敏感。但AFP-L3不能直接證實(shí)肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。1994年Matsumura等[4]首先報(bào)道采用巢式RT-PCR從有肝外轉(zhuǎn)移的HCC患者外周血檢測出AFPmRNA,作為肝癌細(xì)胞血液播散標(biāo)志。但有一部分學(xué)者[5-6]并不支持AFPmRNA作為肝癌細(xì)胞血液播散標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示,AFP-L3和AFPmRNA聯(lián)合檢測陽性率可達(dá) 87.6%,而AFP、AFP-L3、AFPm-RNA單獨(dú)檢測陽性率分別為69.5%、81.7%、36.6%,AFP-L3、AFPmRNA聯(lián)合檢測陽性率與AFP、AFPmRNA單獨(dú)檢測陽性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因外周血AFPmRNA水平與血AFP濃度間無明顯關(guān)系,故可提高HCC診斷的靈敏度和陽性檢出率,具有互補(bǔ)性;且可彌補(bǔ)總AFP濃度不能反映HCC有無轉(zhuǎn)移的不足對(duì)AFP陰性肝癌的診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學(xué)[M].第2版.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,2001:553.

2 Purves LR,van der Merwe E,Bersohn I.Variants of alpha-fetoprotein[J].Lancet,1970,2(7670):464-465.

3 Yoshida S,Kurokohchi K,A rima K,et al.Clinical significance of Lens culinaris agglutinin-reactive fraction of serum alpha-fetop rotein in patients with hepatocellular carcinoma[J].Int JOncol,2002,20(2):305-309.

4 Matsumura M,Niwa Y,Kato N,et al.Detection of a-fetop rotein mRNA.an indicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma,in the circulation:a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1994,20:1418-1425.

5 施裕新,林文堯,陸 鍵,等.外周血中AFPmRNA檢測對(duì)原發(fā)性肝癌高危人群監(jiān)測的意義[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2001,8(4):313-139.

6 Liu Y,Zhang BH,Qian GX,et al.Ex pression of AFPmRNA in blood of patients with recurrent hepatocellular carcinoma[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2003,2(2):274-277.