腎透明細胞癌NOTCH1與JAG1的表達及意義

吳科榮 張立 許樂 侯君* 程躍 李和明 謝國海 嚴澤軍 蔣照輝

(1.浙江省寧波市第一醫(yī)院泌尿外科,浙江寧波 315010;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科,*病理科,上海 200032)

腎透明細胞癌是泌尿系統(tǒng)最重要的惡性腫瘤之一,已經(jīng)證實其發(fā)生發(fā)展與Von Hippel-Lindau(VHL)抑癌基因失活有關(guān)。以此理論為基礎(chǔ)針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體的分子靶向治療目前已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移性腎癌的一線治療,但其仍然存在著有效率低、不良反應(yīng)明顯等缺點[1-3]。隨著對腎癌分子基因的進一步了解,有更多的信號通路進入人們的視線,通過對這些通路的研究,不僅可以進一步了解腎癌的發(fā)病機制,而且可能提供其他的治療靶點。Notch通路是進化上十分保守的通路,其在細胞一系列的生理活動(包括細胞分化、增殖、凋亡、粘附、遷移及血管形成等)中都起到了十分重要的作用,而異常的Notch信號途徑與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4-6]。Notch通路與腎癌的關(guān)系尚不十分明確。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測跨膜受體蛋白(NOTCH1)和Jagged1基因(JAG1)在腎癌組織及正常腎組織中的表達,并探討其表達與臨床病理特征的關(guān)系以及NOTCH1與JAG1作為腎癌生物學(xué)指標的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2003—2008年在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行腎癌手術(shù),術(shù)后病理證實為腎透明細胞癌的患者129例。其中男性84例,女性45例;年齡27～83歲,平均55.5歲。手術(shù)方式:腎根治術(shù)122例(94.6%),腎部分切除術(shù)7例(5.4%)。腫瘤按TNM(2002 AJCC)分期:Ⅰ期81例,Ⅱ期17例,Ⅲ期24例,Ⅳ期7例。按Fuhrman分級:1級53例,2級54例,3級18例,4級4例。腫瘤大小1.5～15 cm,平均 5.3 cm。129例中有 37例(28.7%)腫瘤復(fù)發(fā),92例(71.3%)未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。取正常腎組織33例作為對照。所有組織標本采用10%甲醛固定,石蠟包埋,5μm連續(xù)切片。

1.2 主要試劑 一抗:兔抗人NOTCH 1多克隆抗體(ab27526)(購自 Abcam,UK);羊抗人JAG1多克隆抗體 (sc-6011)(購自Santa Cruz,USA)。二抗:羊抗兔抗體(購自上海長島);兔抗羊抗體(購自北京中衫金橋)。

1.3 免疫組化染色 采用EV二步法染色,石蠟切片60℃烘烤,常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水;3%新鮮雙氧水避光孵育30 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗滌;熱抗原修復(fù)(抗原修復(fù)液為p H 6.0枸櫞酸鹽緩沖液);滴加一抗,室溫下孵育1 h,pH 7.4的PBS洗滌3次,滴加辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1 h后,PBS洗滌3次,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,干燥后中性樹膠封片。用已知乳腺導(dǎo)管癌陽性切片做陽性對照,以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 染色結(jié)果判定 所有的染色片均由3位觀察者獨立評價,這3位觀察者對病例的信息均無任何了解。染色強度和染色程度的評價依據(jù)為既往的文獻[7]報道:先在低倍鏡下隨機選擇3個視野(×40),計數(shù)100個腫瘤細胞陽性百分比,定義無細胞染色為陰性,1%～20%細胞染色為1分,21%～60%細胞染色為2分,61%～100%細胞染色為3分。然后通過觀察高倍鏡(×200)下腫瘤細胞染色強度,定義不著色為0分,淺棕黃色為1分,棕黃色為2分,深褐色為3分。免疫染色評分(immunoreactive score)為上述2項指標之和,定義0～3分為蛋白低表達,4～6分為蛋白高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均選用SPSS 11.5軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。相關(guān)性檢驗采用卡方檢驗和Spearman相關(guān)分析,檢驗水準α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎癌及正常腎組織中NOTCH 1、JAG1的表達 NOTCH 1、JAG1在腎癌組織中免疫組化染色主要表現(xiàn)為腫瘤細胞胞膜染色和(或)胞漿染色,小部分腫瘤細胞核亦染色(圖1、2)。NOTCH 1、JAG1在正常腎組織中的陽性表達率分別為36.4%(12/33)、42.4%(14/33),在腎癌中的陽性表達率分別為 95.3%(123/129)、93.0%(120/129),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。

2.2 NOTCH 1與JAG1的表達相關(guān)性 用免疫染色評分判斷2個蛋白的表達。Spearman相關(guān)分析顯示:NOTCH 1表達和JAG1表達呈正相關(guān)(r=0.384,P＜0.001)。

2.3 NOTCH 1、JAG1表達與腎癌臨床病理的相關(guān)性 隨著腎癌病理分級和臨床分期的增高,NOTCH1和JAG1的表達水平均增高(P＜0.05)。NOTCH1和JAG1的表達水平還與腫瘤大小有關(guān),在直徑≥5 cm腫瘤中的表達高于在直徑＜5 cm腫瘤中的表達(P＜0.05)。復(fù)發(fā)組 NOTCH 1和JAG1蛋白的表達水平均高于未復(fù)發(fā)組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。兩者的表達水平在不同年齡和不同性別的病例中無顯著差異(表1)。

表1 NOTCH1、JAG1的表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系(例)

3 討 論

Notch廣泛表達于從無脊椎動物到哺乳動物等多個物種,是一個在進化上十分保守的跨膜受體蛋白家族。Notch最早在T急性淋巴細胞白血病(TALL)研究中受到關(guān)注。在 T-ALL患者中存在 t(7;9)(q34;q34.3)染色體異位;盡管另外一部分病例不存在這種染色體異位現(xiàn)象,但Notch信號過度表達卻很常見[8]。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Notch通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著“促進”的作用:Notch通路的組成蛋白,尤其是NOTCH1與JAG1高表達,并且這種高表達往往提示乳腺癌患者的預(yù)后不良[9]。有報道JAG1在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中的表達明顯高于在局限性前列腺癌中的表達,并且其表達水平高低與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān):JAG1高表達的前列腺癌病例的腫瘤復(fù)發(fā)概率比JAG1低表達的前列腺癌病例高。

目前Notch與腎癌的關(guān)系尚不十分明確。Sun等[10]的研究結(jié)果顯示Notch在腎透明細胞癌中低表達。然而有學(xué)者[11-12]發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌中NOTCH3、JAG1表達增加。Nilay等[13]研究結(jié)果顯示Notch在透明細胞癌中的表達是在正常腎組織表達的9倍。Sj?lund等[14]則在腎透明細胞癌細胞株中測得Notch通路各組成蛋白存在并且高表達,并且這種表達相對獨立于經(jīng)典通路中VH L、HIF-1a、HIF-2a的表達;Notch通路各組成蛋白在腎透明細胞癌組織中的表達高于在正常腎組織中的表達,其中又以NOTCH 1和JAG1最為顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌組織NOTCH1與JAG1陽性表達率高于正常腎組織。而隨著腎癌的病理分級、臨床分期的增高和腫瘤的增大,NOTCH1和JAG1的表達水平均增高。本研究結(jié)果提示Notch通路與腎透明細胞癌的密切聯(lián)系:Notch高表達可能與腎透明細胞癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。復(fù)發(fā)組NOTCH 1和JAG1蛋白的陽性表達率均高于未復(fù)發(fā)組,提示兩者對臨床預(yù)后判斷可能具有一定價值。

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