γ-hGH對乳腺癌細(xì)胞 MCF-7的放射敏感性研究

戴啟明 周士福 劉小健 時偉峰

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1],保乳術(shù)后緊隨著外部放療是目前局限性乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)化治療,同時是預(yù)防保留乳房手術(shù)后局部復(fù)發(fā)的重要手段。重組人生長激素(recombinant human growth hormone,γ-hGH)在促進 Turner綜合征和慢性腎臟病患生長[2]、治療充血性心力衰竭[3]、治療重癥急性胰腺炎[4]、糾正低蛋白血癥[5]等方面有重要作用,但 γhGH對乳腺癌細(xì)胞 MCF-7放療增敏方面的作用研究較少。本實驗就 γ-hGH對乳腺癌 MCF-7的放射敏感性做一研究,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。10%胎牛血清、DMEN培養(yǎng)基購自杭州四季清公司,γ-hGH由本醫(yī)院中心實驗室惠贈,流式細(xì)胞儀、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱等相關(guān)儀器由本院中心實驗室提供,照射器由本院放療科提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將實驗分為以下 4組,每組設(shè) 5個復(fù)孔。對照組 :MCF-7+DMEN培養(yǎng)基;照射組 :MCF-7+DMEN培養(yǎng)基 +照射;作用組 :MCF-7+DMEN培養(yǎng)基 +r-hGH;聯(lián)合作用組:MCF-7+DMEN培養(yǎng)基 +r-hGH+照射。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及電子射線照射 將乳腺癌 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于 37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中后,每天觀察細(xì)胞生長情況,待細(xì)胞處于對數(shù)生長期即可用于實驗。實驗開始前 24 h更換培養(yǎng)基、胰酶消化,利用計數(shù)板方法計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目,待乳腺癌細(xì)胞數(shù)調(diào)整為 1×105/m l,接種于 6孔板培養(yǎng)。按照上述分組處理細(xì)胞后,繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)時間按照實驗的需要來決定。其中電子線照射由本院放療科工作人員利用直線加速器照射,6 Mev、劑量 4 Gy垂直照射細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁面,照射時間為 3 min。

1.3 細(xì)胞計算方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將上述 4組經(jīng)處理后,繼續(xù)放置培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后,用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞凋亡率。

1.3.2 活細(xì)胞計數(shù)測定細(xì)胞存活率 將上述 4組經(jīng)處理后,繼續(xù)放置培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h后,臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞存活率的計算公式如下:細(xì)胞存活率 =每組活細(xì)胞平均數(shù)/對照組活細(xì)胞平均數(shù) ×100%。

1.3.3 克隆形成法測定細(xì)胞抑制率 將上述 4組經(jīng)處理后,將細(xì)胞用 0.25%胰酶消化,1×105個細(xì)胞接種于 36 cm2培養(yǎng)皿中,每天觀察細(xì)胞生長情況,根據(jù)需要更換培養(yǎng)液,培養(yǎng) 10天后,10%亞甲基藍(lán)染色 20 min、晾干,顯微鏡下觀察并計數(shù),計數(shù)大于 50個細(xì)胞的克隆數(shù)。用抑制率表示不同處理因素對細(xì)胞克隆形成的影響。各組抑制率 =(1-各組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組作用下的細(xì)胞凋亡率

對照組為 0.00%,照射組為(1.06%±0.48%),作用組為(0.96%±0.38%),聯(lián)合作用組(10.8%±3.46%)。照射組和對照相比,凋亡率有所上升(P＜0.05),作用組和對照組相比,凋亡率有所上升(P＜0.05),聯(lián)合作業(yè)組和對照組相比,凋亡率呈明顯下降(P＜0.01),聯(lián)合作用組和照射組、作用組相比,凋亡率也明顯改變(P＜0.05),而照射組和作用組相比,凋亡率卻無明顯改變(P＞0.05)。

2.2 各組作用下的細(xì)胞存活率

對照組、照射組、作用組、聯(lián)合作用組的細(xì)胞存活率分別為:100.0%、51.7% ±1.10%、57.7% ±1.20%、11.0%±1.00%,其中照射組、作用組和對照組相比有所下降(P均 ＜0.05);聯(lián)合作用組和對照組相比,細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.01);而照射組和作用組并無明顯改變(P＞0.05);聯(lián)合作用組和照射組、作用組相比也有所下降(P均 ＜0.05)。

2.3 各組作用下的細(xì)胞抑制率

對照組、照射組、作用組、聯(lián)合作用組的細(xì)胞抑制率分別為 0、20.9%±0.65%、26.0%±1.10%和 67.9%±0.93%,和對照組相比,照射組、作用組的抑制率有所增加(P＜0.05),而聯(lián)合作用組則明顯增加(P＜0.01),照射組和作用組并無明顯改變(P＞0.05),聯(lián)合作用和照射組、作用組相比也有所增加(P均 ＜0.05)。

3 討論

生長激素是由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的 1種蛋白質(zhì)激素,由 191個氨基酸殘基組成,它的主要功能是促進物質(zhì)的代謝和生物的生長發(fā)育。最早被人們認(rèn)識和運用的作用是促進人體生長,它通過促生長因子或胰島素樣生長因子介導(dǎo)作用于軟骨組織,增加骨骼的長度,從而促進人體的線性生長。生長激素 1958年首次被提取,由于當(dāng)時條件的限制,人生長激素的來源僅為尸體腦垂體,所以生產(chǎn)量有限,因此人們開始研究以化學(xué)合成和基因重組方法生產(chǎn)人生長激素。1986年基因工程的發(fā)明人之一、諾貝爾獎獲得者波耶爾通過基因重組技術(shù)成功合成了重組人生長激素,其結(jié)構(gòu)與人垂體分泌的生長激素完全相同[6]。γ-hGH大量生產(chǎn)后,人們對它的臨床應(yīng)用開始越來越多的進行研究。而乳腺癌患者保乳手術(shù)后的放療一直是個控制局部復(fù)發(fā)率的有效手段。早期乳腺癌保乳治療的原理是用手術(shù)切除乳腺原發(fā)病灶,用中等劑量放療控制乳腺內(nèi)亞臨床灶,達(dá)到與改良根治術(shù)相同的效果,不僅保留了完整的乳房,有著很好的美容效果及功能,而且其長期生存率、局部控制率均和根治術(shù)或改良根治相同[7]。許多學(xué)者經(jīng)過長期的隨訪發(fā)現(xiàn)當(dāng)保乳手術(shù)后不予放療明顯提高局部的復(fù)發(fā)率[8,9],因此對乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的研究有一定的意義。

我們本實驗?zāi)康氖怯^察 γ-hGH是否能增強乳腺癌 MCF-7細(xì)胞對電子射線的敏感性。但乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性除了和射線的種類和劑量有關(guān),也和腫瘤細(xì)胞的分子生物學(xué)等許多因素密切相關(guān)。從本次實驗的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),在聯(lián)合作用組下的細(xì)胞凋亡率和對照組、照射組、作用組相比,均明顯增加(P均 ＜0.05),細(xì)胞存活率均相應(yīng)地減少(P均 ＜0.05),細(xì)胞抑制率均明顯增加(P＜0.01),說明經(jīng)過 γ-hGH作用后再予以電子射線照射明顯可以提高細(xì)胞的凋亡率,降低細(xì)胞存活率,乳腺癌細(xì)胞受抑制的情況也更加嚴(yán)重。這些現(xiàn)象可以說明經(jīng)放射和 γ-hGH聯(lián)合作用下具有一定的協(xié)同作用,同時也說明了 γ-hGH能夠增強乳腺癌 MCF-7細(xì)胞對電子射線的放射敏感性,其中的原因可能是因為作用于乳腺癌 MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期內(nèi)有絲分裂中的靶點。

γ-hGH在臨床上的應(yīng)用范圍正日益擴大,而從本次實驗中得出的 γ-hGH能夠增強乳腺癌 MCF-7細(xì)胞對電子射線的放射敏感性這一結(jié)論將有可能為標(biāo)準(zhǔn)化的保乳手術(shù)術(shù)后治療提供一定的幫助。

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