非小細胞肺癌 EGFR熒光原位雜交與免疫組化檢測的比較

陳順平 余英豪

近年來,隨著對非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)發生、發展過程中分子生物學機理的深入研究,以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)為治療靶標的分子靶向治療在NSCLC的治療中日漸突出。因此,檢測 EGFR基因不但可以有效指導分子靶向藥物的使用,而且可以為肺癌的治療措施的制定、以及肺癌預后的判定提供了重要的信息。本文擬采用熒光原位雜交(FISH)技術對我院非小細胞肺癌石蠟樣本進行 EGFR基因進行檢測,并結合免疫組化法檢測 EGFR蛋白表達的情況,比較 2種方法的差異,為臨床篩選 EGFR酪氨酸激酶抑制劑適用者及選擇最佳治療方案提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

標本來源:27例患者均為我院 2009年 6月 ～2009年 12月行肺癌手術切除的病例,其中男性 15例,女性 12例;年齡 43～79歲,中位年齡 61歲。所有標本均經 10%中性緩沖福爾馬林液固定,常規石蠟包埋。病理類型:肺泡癌 10例、肺腺癌 9例、混合癌 8例。27例同時進行免疫組化及 FISH檢測。

1.2 主要試劑與儀器

酸性亞硫酸鈉(美國 Simga產品),蛋白酶 K(美國羅氏產品),探針:GLPEGFR/CSP7探針由北京金菩嘉公司提供。人抗 EGFR單克隆抗體(即用型)購于福州邁新生物公司,產品編號 MAB0196。

Olympus BX51型熒光顯微鏡、Dake原位雜交儀、電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養箱。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 FISH檢測:①將 3μm組織涂膠切片浸于二甲苯中脫蠟至水。②50℃下用 30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片 30～40 min。③室溫下用 2×SSC×3min×2次漂洗。④在組織上滴上自己配制即用型蛋白酶 K,在 37℃預熱的孵育盒中消化 25～35 min。⑤室溫下用 2×SSC×3 min×2次漂洗,乙醇梯度脫水固定,自然干燥。⑥避光環境中,玻片和探針混合液(7μl雜交緩沖液、1μl去離子水和 2μl探針),探針混合液滴于雜交區域,在溫度 83℃的自動雜交儀中變性 6 min后置 37℃過夜雜交。⑦洗滌:第 2日移去蓋玻片,在溫度 46℃,玻片置于 2×SSC×10 min×2次,2×SSC/0.1%NP-40溶液中 5 min。玻片干燥后加 DAPI復染液,放于暗盒中復染數分鐘后用 OLYMPUSBX51熒光顯微鏡在 DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發下觀察間期細胞熒光雜交信號。

IHC檢測:采用 EnVision二步法,EGFR一抗工作濃度為 1∶150,嚴格按照說明書操作。

1.3.2 結果判定 (1)FISH結果判定:紅色信號代表檢測的靶基因,綠色信號代表靶基因所在的染色體著絲粒。檢測 EGFR基因計數 100個細胞,統計 Ratio值(100個細胞核中紅色信號數/100個細胞核中綠色信號數)。FISH陽性分為:EGFR基因擴增:①Ratio≥2為陽性結果;②≥15個紅色信號的細胞數占細胞總數的 10%以上;③出現成團紅色信號的細胞;高多體性:Ratio＜2,但≥4個紅色信號的細胞數占細胞總數的40%以上。FISH陰性:Ratio＜2為無擴增。(2)IHC結果判定:染色結果根據細胞膜著色的陽性細胞百分率和陽性染色程度評價。著色細胞占計數細胞百分率≤5%為 0分;6～25%陽性細胞為 1分;26～50%陽性細胞為 2分;＞50%陽性細胞為 3分。再結合染色強度,無色為 0分,淺黃色 1分,棕黃色 2分,棕褐色 3分。將每張切片著色細胞百分率得分與著色程度得分相乘,為其最后得分。同一視野如有染色強度不一,取其平均值作最后得分。0～1分為陰性(-),2～3分為弱陽性(+),4～6分為中等陽性(2+),6分以上為強陽性(3+)。

1.4 統計學處理

采用 SPSS13.0統計軟件進行描述性分析。

2 結果

27例 NSCLC標本中,IHC法檢測 EGFR表達(3+)的 14例,有 9例 FISH顯示陽性 (64.29%),這 9例中有 5例為 EGFR基因高多體性擴增(55.56%),4例為 EGFR基因擴增(44.44%);IHC為(2+)的 6例標本中,僅有 1例為高多體性擴增(16.67%);IHC為(1+)的 2例以及 5例 IHC(-)的標本均無 EGFR基因擴增。在 10例擴增的標本中,高多體性擴增(6例)超過一半。

3 討論

EGFR屬于表皮生長因子家族成員[1],又稱HER1,EGFR基因位于人類 7號染色體的短臂,由 118 kb組成,包括 28個外顯子。EGFR在多種上皮性腫瘤中呈高表達,其過表達與腫瘤細胞的增殖、活動性、粘連性、侵襲性、凋亡抑制和血管生成相關,能導致其下游信號傳遞過程異常激活,使細胞的轉化、增殖加快,抵抗細胞凋亡、細胞生存期延長,與腫瘤的發生、發展、預后以及治療反應等相關[2]。EGFR在上皮性腫瘤發生發展過程中發揮著關鍵作用,配體通過 EGFR信號通路來調節細胞增殖、存活和血管生成,由于 EGFR酪氨酸激酶是信號傳導的必要條件,因而成為腫瘤治療的重要靶分子。通過選擇性的酶抑制劑或單克隆抗體競爭性結合細胞外配體結合位點可以阻斷酪氨酸激酶活化,從而抑制 EGFR的激活,阻礙腫瘤的發生發展。以 EGFR為靶標的分子靶向藥物如 EGFR酪氨酸激酶抑制劑 Iressa(Genfitinib)已被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療晚期 NSCLC,治療 EGER基因擴增 NSCLC患者中,有效率為 35%,疾病控制率高達70%[3]。同時,多數臨床 III期試驗表明,EGFR高拷貝數患者使用酪氨酸激酶抑制劑后生存顯著高于 EGFR低拷貝數患者,因此,EGFR拷貝數被認為可能適合作為用藥后生存期判斷的指標[4,5]。

IHC是目前臨床上常用的檢測 EGFR蛋白表達的方法。該方法簡便、價廉、可重復性好、對材料的要求不高,在臨床上廣泛應用,是國內檢測 EGFR蛋白表達的主要方法。但是,IHC方法在標本固定和處理中可能會使蛋白質變性破壞而影響檢測結果,易造成假陰性或假陽性,且結果判斷人為主觀性較強 。FISH是近年來發展起來的分子生物學技術,已被廣泛用于臨床醫學檢測,且 FISH技術敏感性和特異性高、簡便快速、客觀性強,實驗過程中受到的影響較小,檢測結果準確,也可以定量判讀結果,但費用相對較昂貴。

本實驗中,我們對 27例 NSCLC患者進行 FISH檢測 EGFR基因狀態并結合其免疫組化結果進行對比分析發現,當 IHC法為強陽性(3+),FISH陽性符合率僅為 64.29%,符合率較低,而對于(2+)的患者中,只有 1例為高多體性擴增,符合率為 16.67%。因此,我們認為,對于 IHC為陽性(3+)和(2+)患者需再做FISH實驗確定是否存在 EGFR基因擴增。IHC法為(+)或者(-)的標本,FISH法的結果均為無擴增。同時,在 10例擴增的標本中,有 6例為高多體性擴增,占到擴增例數的大多數,說明由 7號染色體引起的EGFR基因多體性擴增較為常見,其鏡下表現為癌細胞核中紅色信號點數較多,但還未成團,信號各個點數清晰易辨,伴隨著染色體著絲粒綠色信號點數的增加。同時,我們在判讀過程也發現除了多體性擴增引起的紅色信號點數增加外,EGFR基因擴增鏡下一般表現為紅色信號點成簇狀集聚。因此,我們認為對于 IHC法初篩為陰性(-)或(+)的患者,基本上可排除 EGFR基因擴增;而對于 IHC法初篩為(3+)和(2+)的患者,2種方法的符合率相對較低,特別是(2+)的患者,在應用靶向藥物治療前均應進行 FISH檢測以確定 EGFR基因的狀態。

綜上所述,應用 FISH技術對 EGFR基因擴增檢測可以對 IHC的補充,也避免 IHC假陽性對 NSCLC患者應用酪氨酸激酶抑制劑治療效果的誤判,增加患者的負擔。同時,FISH是1種快速,簡便,結果可靠的基因檢測方法,易在臨床得到認可。IHC的經濟性可用于排除 NSCLC患者中 EGFR基因的擴增,FISH可用于確診,這 2種方法相互補充將對于臨床應用酪氨酸激酶抑制劑具有指導作用。

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