FISH技術在病理蠟塊操作中的應用體會

陳順平 余英豪

現行的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術操作較為繁瑣且實驗結果較不穩定,我們結合自己的經驗,對FISH的操作進行改進,應用過程中獲得了良好雜交效果,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

來源于 55例本院病理科組織蠟塊標本,其中非小細胞肺癌(檢測 EGFR基因)標本為 35例,浸潤性乳腺癌(檢測 HER-2基因)標本為 20例。主要試劑有酸性亞硫酸鈉(美國 Simga產品),蛋白酶 K(美國羅氏),探針:GLP EGFR/CSP探針和 GLP HER-2/CSP17探針由北京金菩嘉公司提供。主要儀器有 Olympus BX 51型熒光顯微鏡、Dake原位雜交儀、電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養箱。

1.2 方法

①將 3μm組織涂膠切片浸于二甲苯中脫蠟至水,用紙巾吸取多余的水分。②50℃下用 30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片 30～40min。③室溫下用 2×SSC×3m in×2次漂洗。④在組織上滴上自己配制即用型蛋白酶 K,在 37℃預熱的孵育盒中消化 25～35min。⑤室溫下用 2×SSC×3min×2次漂洗,乙醇梯度脫水固定,自然干燥。⑥避光環境中,玻片和探針混合液(7μl雜交緩沖液、1μl去離子水和 2μl探針),探針混合液滴于雜交區域,在溫度 83℃的自動雜交儀中變性 6m in后置 37℃過夜雜交。⑦洗滌:第 2日移去蓋玻片,在溫度 46℃,,玻片置于 2×SSC×10min×2次,2×SSC/0.1%NP-40溶液中 5min。玻片干燥后加 DAPI復染液,放于暗盒中復染數分鐘后用 OL YMPUSBX 51熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發下觀察間期細胞熒光雜交信號。

1.3 結果判定

紅色信號代表檢測的靶基因,綠色信號代表靶基因所在的染色體著絲粒。檢測 EGFR基因計數 100個細胞,統計 Ratio值(100個細胞核中紅色信號數/100個細胞核中綠色信號數),FISH陽性:(1)EGFR基因擴增 ①Ratio≥2為陽性結果;②≥15個紅色信號的細胞數占細胞總數的 10%以上;③出現成團紅色信號的細胞。(2)高多體性 Ratio＜2,但≥4個紅色信號的細胞數占細胞總數的 40%以上。檢測 HER-2基因計數 30個,Ratio＜1.8為陰性結果,Ratio＞2.2為陽性結果,Ratio在 1.8～2.2之間時,可以選擇增加計數或重做。

2 結果

55例病理蠟塊標本中 48例一次性雜交成功,且雜交成功率為 87.3%。其中 2例消化不夠,在 DAPI通道控制下,延長了消化時間,全部雜交成功。有 5例信號點較弱,但不影響判斷。

3 討論

FISH技術是近幾年生物學領域的一項新技術,現廣泛用于醫學檢測[1]。然而,FISH實驗結果較為不穩定性且操作繁瑣。通過實踐,我們對病理組織進行 FISH檢測的體會主要有以下幾點:①酶消化方法。我們取消了國內 FISH現行的浸入消化,采用自己配制的即用型的蛋白酶 K滴入組織區域消化,37℃溫箱孵育,實驗取得良好的效果,克服浸入消化的不均一性。蛋白酶K容易沉淀,應及時混勻,浸入消化容易使組織標本上下區域消化不均,前后的標本消化不均,特別是標本量較大的時候,且酶用量大,成本較高,操作也繁瑣。②在洗滌方面,將 2×SSC×10min代替了現行的 3遍 50%甲酰胺洗滌,對結果判斷無影響,節約了時間和成本,避免了甲酰胺對身體的損害。③組織細胞類型較為復雜且大部分還伴隨大量纖維,消化效果較難于控制。在進行雜交之前應在組織上滴加 DAPI復染液,在熒光顯微鏡下判斷消化效果,組織中被雜交細胞在 RHOD和FITC的通道下,細胞核應為薄紗狀,亮度一般,DAPI通道下細胞核膜應完整,顏色深淺適中,背景清晰,核外無過多雜質[2]。④判斷細胞消化時,我們認為 RHOD和FITC、DAPI三通道應聯合判斷細胞消化效果,DAPI通道可作為判斷細胞是否消化過頭的首選通道,而 RHOD和 FITC的通道可作為判斷細胞消化是否合適。⑤石蠟切片預處理過程很重要,每一次實驗時間跟溫度要統一,一般 50℃用 30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片 30～40min,時間太長或太短不利于酶消化時間的控制。⑥石蠟切片厚度一般為3μm較佳,切片過厚細胞容易聚集一起,極易造成各個細胞信號計數困難,且切片越厚預處理時間和消化時間要適當延長才不影響探針結合,使結果較為穩定。

[1] 王泊沄.病理學技術〔M〕.北京:人民衛生出版社,2000:595.

[2] 陳順平.FISH中酶消化細胞的幾點體會〔J〕.臨床與實驗病理學雜志,2010,26(1):116.