離子通道相關蛋白FXYD6功能區(qū)的原核表達及純化

陳雄飛，周寧新

(1遼寧醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001;2中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院)

苯丙氨酸-X-酪氨酸—天冬氨酸(FXYD)基因家族蛋白是一類小分子的單跨膜蛋白，有離子通道或離子通道調(diào)節(jié)作用，和Na+-K+-ATP酶的結(jié)構(gòu)功能密切相關。FXYD6蛋白是FXYD家族新成員，近期研究顯示其與精神病易感性、內(nèi)耳聽神經(jīng)平衡功能及腫瘤等有關。2010年4月，我們對FXYD6功能區(qū)(FXYD6-ex)進行了原核表達及純化，旨進一步研究FXYD6蛋白的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①載體和菌種:克隆質(zhì)粒載體PMD18-T Simple、XhoⅠ和ECORⅠ酶切后的表達質(zhì)粒載體pET28a(中國科學院生物物理所閻錫蘊教授惠贈)、克隆菌株Trans 10感受態(tài)細胞、表達菌株大腸桿菌Rossetta。②主要試劑:全長FXYD6cDNA序列，XhoⅠ、ECORⅠ限制性內(nèi)切酶，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒，His-Tag單克隆抗體，高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒，LB培養(yǎng)基。

1.2 FXYD6-ex目的基因擴增和純化 采用SignalP 3.0軟件進行FXYD6蛋白預測，前18個氨基酸為信號肽。用全長FXYD6cDNA序列擴增除信號肽外的功能區(qū)FXYD6-ex，利用Primer 5.0引物設計軟件，設計一對PCR引物，并在每條引物的5＇端引入限制性內(nèi)切酶識別序列。上游引物:5＇-GAATTCAGTGCAGCTGTGAAAAGGAG-3＇，5＇末端含有限制性內(nèi)切酶ECORI的切割位點;下游引物:5＇-CTCGAGTCAGTTCTCTGCTTTCTGG-3＇，5＇末端含有限制性內(nèi)切酶XhoI的切割位點;引物合成由英駿生物技術有限公司完成，測序由北京博尚生物技術有限公司完成。PCR擴增條件:95℃預變性5 min，變性—退火—延伸的反應循環(huán)為95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，共36個循環(huán)，72℃延伸10 min，將 PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察，膠回收試劑盒回收目的片段。

1.3 表達質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 將1.2目的回收片段與pMD18-T Simple載體連接，并轉(zhuǎn)入克隆載體大腸桿菌Trans10中進行質(zhì)粒擴增，以質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并用Xhol、ECORI雙酶切，瓊脂糖凝膠上樣電泳，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將純化的酶切產(chǎn)物與已酶切的pET-28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)入表達載體Rossetta中，兩次重組質(zhì)粒均經(jīng)PCR鑒定及測序。

1.4 FXYD6重組蛋白表達及檢測 Rossetta菌生長至對數(shù)期后用1 mmol/L異丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)誘導表達目的蛋白，同時設未加ITPG者為對照組，4 h后收集兩組培養(yǎng)液各1 ml，離心收集菌體沉淀，用 100 μl 1×loading buffer重懸，100 ℃煮10 min，離心后吸取上清液置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?5%的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠，15 μl/孔上樣，考馬斯亮藍染色，脫色后觀察表達蛋白條帶。

1.5 FXYD6重組蛋白純化及檢測 ①純化:離心收集IPTG誘導后的陽性克隆菌體，用含25 mM Tris、150 mM NaCl的裂解液重懸，冰上超聲破碎至菌液清亮。15000 rpm 4℃離心20 min后取沉淀，用 25 mM Tris、150 mM NaCl、0.1%Triton X-100 溶液重懸，同樣條件離心后取上清，將含有His標簽融合蛋白的裂解上清流經(jīng)Ni-NTA金屬螯合柱進行層析純化，用50 mM咪唑洗脫液競爭結(jié)合Ni2+位點，洗脫目的蛋白，超濾將目的蛋白換至PBS緩沖液并進行濃縮。②檢測:利用Western blot法。樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)到NV膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入小鼠源性 His Tag單抗(一抗)，37℃輕搖1.5 h，PBS洗膜3次、每次 5 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(二抗)，37℃輕搖1 h后同上洗滌，用高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒顯色，暗室X線壓片、曝光、顯影后觀察。

2 結(jié)果

2.1 FXYD6-ex目的片段獲得及重組質(zhì)粒鑒定PCR產(chǎn)物電泳后在DNA marker 200～300 bp出現(xiàn)單一條帶產(chǎn)物，片段大小與預期產(chǎn)物大小相符;連接后的pMD18-T Simple Vector和PET-28a經(jīng)酶切、電泳后亦出現(xiàn)單一目的條帶，測序鑒定證實序列完全正確，可進行后續(xù)實驗。

2.2 FXYD6重組蛋白誘導表達與檢測 經(jīng)IPTG誘導4 h后菌體蛋白相對分子質(zhì)量約17 kD，較對照組出現(xiàn)明顯誘導條帶。

2.3 FXYD6重組蛋白純化及檢測 目的蛋白經(jīng)Ni柱分離純化、SDS-PAGE電泳后所得目的蛋白純度達90%;Western blot檢測顯示，SDS-PAGE上出現(xiàn)的明顯誘導條帶及純化所得蛋白可被HisTag抗體識別，而未經(jīng)IPTG誘導的對照組對應位置未出現(xiàn)條帶。

3 討論

FXYD6蛋白全稱為包含F(xiàn)XYD結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)因子6，屬小分子Ⅰ型膜蛋白。FXYD6基因mRNA首先由Fuminori等于2001年自大鼠腦和腎臟中克隆出，此后的研究主要集中在FXYD6與神經(jīng)系統(tǒng)的關系方面(如神經(jīng)元的發(fā)育和精神疾病等)。Kadowaki等研究結(jié)果表明，大鼠出生后3周時FXYD6的表達在大腦最高，并一直延續(xù)至成年。提示FXYD6對于大鼠大腦神經(jīng)元的興奮性有重要作用。有關FXYD6與精神分裂癥易感性相關性方面的研究，美國、日本和中國研究者得出的結(jié)論不一致［1～3］。近期研究顯示，F(xiàn)XYD6 蛋白對 Na+-K+-ATP酶的影響有助于產(chǎn)生和維持內(nèi)淋巴的內(nèi)耳蝸勢能和離子成分穩(wěn)定，有助于保持內(nèi)耳聽神經(jīng)的平衡功能［4，5］。目前，有關 FXYD6與腫瘤關系的研究鮮見報道，但FXYD家族突變或缺失很可能引起嚴重病理變化。已有研究報道FXYD3在人乳腺癌中高表達，有望成為人乳腺癌的標志性分子［6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)FXYD6在正常膽管或胰腺組織低表達，在膽管癌或胰腺癌組織中高表達并隨膽管癌或胰腺癌分化程度降低而增高［7，8］;另外，我們用反義核酸技術發(fā)現(xiàn)FXYD6蛋白可促進FXYD6高表達的膽管癌細胞系QBC939和胰腺癌細胞系SW1990細胞增殖。我們近期研究表明，在正常肝組織、肝硬化組織和肝癌組織中FXYD6蛋白陽性細胞比率和FXYD6蛋白表達強度依次顯著性遞增。出現(xiàn)上述研究結(jié)果的可能原因為FXYD6基因定位于11號染色體長臂(11q23.3)，而11號染色體長臂是包括膽管癌、胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞最常見的異常區(qū)。基于此，制備FXYD6不同表位的單克隆抗體用以監(jiān)測其存在和變化非常重要。本研究中，我們采用SignalP 3.0軟件分析FXYD6蛋白作為膜蛋白的功能區(qū)分布，結(jié)果成功進行對FXYD6-ex表達載體的構(gòu)建、可溶性表達及純化。

綜上所述，本研究成功對FXYD6-ex進行原核表達及純化;此為后續(xù)制備該蛋白抗體庫及進一步研究其具體功能奠定了良好基礎。

［1］Choudhury K，McQuillin A，Puri V，et al.A genetic association study of chromosome 11q22-24 in two different samples implicates the FXYD6 gene，encoding phosphohippolin，in susceptibility to schizophrenia［J］.Am J Hum Genet，2007，80(4):664-672.

［2］Ito Y，Nakamura Y，Takahashi N，et al.A genetic association study of the FXYD domain containing ion transport regulator 6(FXYD6)gene，encoding phosphohippolin，in susceptibility to schizophrenia in a Japanese population［J］.Neurosci Lett，2008，438(1):70-75.

［3］Zhang J，Che R，Li X，et al.No association between the FXYD6 gene and schizophrenia in the Chinese Han population［J］.J Psychiatr Res，2010，44(6):409-412.

［4］Delprat B，Schaer D，Roy S，et al.FXYD6 is a novel regulator of Na，K-ATPase expressed in the inner ear［J］.J Biol Chem，2007，282(10):7450-7456.

［5］Delprat B，Puel J，Geering K.Dynamic expression of FXYD6 in the inner ear suggests a role of the protein in endolymph homeostasis and neuronal activity［J］.Dev Dyn，2007，236(9):2534-2540.

［6］Yamamoto H，Okumura K，Toshima S，et al.FXYD3 Protein Involved in Tumor Cell Proliferation Is Overproduced in Human Breast Cancer Tissues［J］.Biol Pharm Bull，2009，32(7):1148-1154.

［7］竇春青，岳鑫，周寧新.hFXYD6反義核酸對膽管癌細胞體外增殖和侵襲能力的影響［J］.世界華人消化雜志，2007，15(10):929-935.

［8］劉軍桂，周寧新，張效東.FXYD6 shRNA表達載體的構(gòu)建及其在體外對胰腺癌細胞增殖的影響［J］.生物技術通迅，2009，20(10):458-461.