卵巢癌細胞卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因的表達變化及其啟動子區甲基化觀察

唐兆前,李 力,張 瑋,王 琪,唐步堅

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院,南寧 530021)

卵巢癌化療藥物耐藥現象成為影響其療效的主要原因。研究發現,在惡性腫瘤中表觀遺傳基因對于調控原發性以及獲得性耐藥都起重要作用[1],其中 DNA甲基化是基因突變及缺失之外腫瘤抑制基因失活的第三種機制。2008年 7月 ～2010年 2月,我們觀察了卵巢癌卡鉑耐藥細胞系(SKOV3-CB)中各抑癌基因啟動子區的甲基化狀態,以探討其與卵巢癌卡鉑耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 RNA抽提試劑 Trizol,逆轉錄試劑盒RevertAid Fiststrand cDNA Synthesis Kit,DNAzol基因組 DNA快速提取試劑盒,Cp Genome DNA修飾試劑盒,凝膠成像系統 quality-one,實時熒光定量 PCR儀,卵巢癌卡鉑耐藥細胞系 SKOV3-CB、親本細胞系SKOV3及其表達譜芯片。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因的篩選

應用分子生物信息學方法,在“www.ncbi.nlm.nih.gov”網站,查找 “tumor suppressor gene”,篩選卵巢癌卡鉑耐藥相關腫瘤抑制基因,共 13個腫瘤抑制基因(VHL、COPS2、NOL7、GGNBP2、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8)表達下調。

1.2.2 SKOV3-CB、SKOV3耐藥相關腫瘤抑制基因表達的檢測 待 SKOV3-CB、SKOV3細胞長滿瓶底的70%～80%時,獲取細胞 1×107～5×107個,移入1.5 ml離心管中。根據 Trizol法提取細胞總 RNA并行凝膠電泳,用紫外分光光度儀檢測抽提總 RNA的質量和濃度。要求 A260/A280為 1.8～2.0,并計算RNA含量。cDNA合成參照逆轉錄試劑盒說明書操作。RT-PCR反應:應用引物設計軟件 Primer 5.0設計引物,并由上海生工生物技術有限公司合成。在DNA Engine Opticon TM連續熒光檢測系統中進行擴增。陰性對照以無 RNA酶的水代替 cDNA模板。每例樣品及對照均設 3個平行復孔,取平均值。反應結束后,由軟件自動得出熒光反應曲線以及每個標本反應體系的擴增效率及 CT值。SKOV3-CB相對于……