豬瘟診斷方法的研究進(jìn)展

葉 芬，蔡家利

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400700；2.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶 400050）

1 豬瘟病毒的分類、形態(tài)與結(jié)構(gòu)

豬瘟隸屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員，病毒粒子略呈圓形，具有脂蛋白囊膜，粒子直徑為34～50nm，從電鏡照片觀察，可見病毒粒子表面有脆弱的纖突結(jié)構(gòu)，病毒核衣殼呈二十面體對(duì)稱，內(nèi)部核心直徑約為30nm。病毒在蔗糖密度梯度中的浮密度是1.15～1.16g/cm3，等電點(diǎn)是4.8。在脂蛋白囊膜上，存在著病毒基因組編碼的囊膜糖蛋白E0（也被稱為ERMS）、E1和E2，組成核衣殼蛋白的C蛋白與病毒基因組相連，以維持核酸的穩(wěn)定性。

2 豬瘟診斷方法研究進(jìn)展

2.1 豬瘟實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)

2.1.1 免疫熒光試驗(yàn) 免疫熒光試驗(yàn)（FAT）是豬瘟的常用診斷方法。豬瘟熒光抗體染色技術(shù)是將提純后的抗CSFV抗體IgG標(biāo)記上熒光物質(zhì)，制成豬瘟熒光抗體染色試劑。用該試劑去著染豬病料（如病豬扁桃體、淋巴結(jié)、腎等）的冰凍切片或觸片，然后利用熒光顯微鏡觀察組織細(xì)胞內(nèi)是否有亮綠色熒光。如果被觀察的組織細(xì)胞內(nèi)有亮綠色熒光，就是豬瘟病毒熒光抗體染色陽性，說明被檢病料中有CSFV感染。反之，被觀察的組織細(xì)胞內(nèi)沒有亮綠色熒光，就是豬瘟病毒抗體染色陰性。

利用熒光抗體技術(shù)檢測病豬內(nèi)臟器官可能存在的CSFV，對(duì)CSF的早期診斷具有十分重要的意義。豬瘟熒光抗體染色技術(shù)在CSFV感染早期檢出率較高，不僅能檢出強(qiáng)毒抗原，還能檢出低毒力病毒感染的帶毒母豬，豬瘟的常規(guī)診斷需要4～5 d，而該項(xiàng)技術(shù)可在12h內(nèi)作出判斷，既快速又客觀、準(zhǔn)確，在規(guī)模化豬場臨床上得到了廣泛應(yīng)用。所以目前許多規(guī)模化大豬場利用熒光抗體染色技術(shù)，有計(jì)劃地對(duì)豬場進(jìn)行豬瘟凈化。

Robert son等首次將FA運(yùn)用于豬瘟病料和組織培養(yǎng)物的檢測。張淑霞等從抗豬瘟高免血清中提取IgG，標(biāo)記熒光素（FITC），制備出了豬瘟熒光抗體（CSFV-FA）。該抗體能夠檢測人工感染豬扁桃體中的病毒抗原，而且這種熒光反應(yīng)能夠被抗CSF高免血清特異性抑制。應(yīng)用CSFV-FA可在病死豬的扁桃體、脾、腎、回腸末端等器官的觸片或冰凍組織切片中發(fā)現(xiàn)病毒抗原，也可先將可疑病料經(jīng)無菌處理后接種于細(xì)胞培養(yǎng)物，隨后再用CSFV-FA檢測出感染細(xì)胞中的豬瘟病毒抗原。FAT法簡單、快速、可靠，許多國家將它作為執(zhí)行豬瘟消滅計(jì)劃的法定診斷試驗(yàn)。

2.1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有高度敏感性和特異性，而且它的試劑比較穩(wěn)定，操作簡單且無放射性危害，特別是商品試劑盒和自動(dòng)化儀器的應(yīng)用，使其成為一種適用于各級(jí)檢驗(yàn)部門的免疫標(biāo)記技術(shù)。隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，酶聯(lián)免疫測定的技術(shù)方法也得到發(fā)展和更新，Dot-ELISA、發(fā)光酶聯(lián)免疫測定、免疫印跡法、BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法都不斷得到應(yīng)用。

周宗元等應(yīng)用豬瘟兔化弱毒PEG沉淀抗原和HRP-SPA建立了HRP-SPA-ELISA檢測CSFV抗體的方法，通過對(duì)5份陰性血清和32頭仔豬注射疫苗前后不同時(shí)期的256份血清進(jìn)行檢測，證明本法有較高的敏感性和特異性。余興龍等以在大腸桿菌中高效表達(dá)的CSFV的E2基因產(chǎn)物為抗原，以HRP標(biāo)記的的兔抗豬IgG為二抗，建立了檢測CSFV抗體的間接ELISA方法，結(jié)果表明用E2基因產(chǎn)物蛋白作為診斷豬瘟的抗原，具有特異性高、易純化和成本低等特點(diǎn)。陸芹章等（2004）制備了豬瘟單克隆抗體，以ACI-ELISA法檢測CSFV，并用PCR方法作比較，結(jié)果表明30份豬瘟陰、陽性病料的ACI-ELISA試驗(yàn)結(jié)果與PCR檢測結(jié)果相符，本方法與動(dòng)物接種、免疫熒光、血清中和等CSF常規(guī)診斷方法比較，更加快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，且一次可檢測大量樣品，同時(shí)比PCR方法耗時(shí)短、費(fèi)用低，便于推廣。陳振海（2005）等以CSFV GST-Erns融合蛋白作抗原進(jìn)行間接ELISA，結(jié)果表明用該方法檢測CSFV抗體具有很高的特異性和敏感性。

目前，已有很多采用基于中和性單抗的競爭ELISA方法來檢測某些病原中和抗體的報(bào)道，說明利用CSFV中和性單抗作為競爭抗體檢測CSFV中和抗體是可行的。梁冰冰等利用桿狀病毒表達(dá)豬瘟病毒（CSFV），以重組E2蛋白作為包被抗原，辣根過氧化物酶標(biāo)記的E2蛋白中和性單克隆抗體作為競爭抗體，建立了一種用于檢測CSFV中和抗體的重組E2蛋白競爭抑制ELISA（CI-ELISA）方法，該法操作簡便、快速，適于現(xiàn)場應(yīng)用，同時(shí)具有一般ELISA的操作優(yōu)點(diǎn)，可以用于大量現(xiàn)場樣品的檢測和流行病學(xué)監(jiān)測。

2.2 分子生物學(xué)診斷方法

2.2.1 常規(guī)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的建立帶動(dòng)了分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）成功測定了多株CSFV的全基因序列，為豬瘟的致病機(jī)理、免疫機(jī)制、檢測防控提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因?yàn)樵谂R床檢測中要經(jīng)常檢測RNA病毒，而通常所用的PCR試劑盒是DNA聚合酶，不能以RNA為模板直接擴(kuò)增，故在進(jìn)行PCR前，先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，所以建立了RT-PCR技術(shù)。隨著人們對(duì)CSFV分子生物學(xué)研究的深入，尤其是對(duì)CSFV Alfort株和 Bresica株基因組全序列的成功測定，使得RT-PCR技術(shù)在CSFV的研究中被廣泛應(yīng)用。RT-PCR作為檢測CSFV的一種方法，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，操作也很簡單，整個(gè)過程在1 d內(nèi)即可完成，能達(dá)到快速檢測的目的，并且適合于各種含毒材料的檢測，也可用于臨床。此外，RT-PCR技術(shù)還可區(qū)別與CSFV相關(guān)的病毒，如BVDV，以及能引起和CSF相似臨床癥狀的豬病病毒，如亞洲CSFV、偽狂犬病病毒，其靈敏度可達(dá)100%。

2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種核酸定量技術(shù)，因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)成為核酸檢測中的重要工具。它是在常規(guī)PCR引物之外加入一個(gè)兩端帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針。該技術(shù)的研究也逐漸成為豬瘟診斷方法研究的方向。由于實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀可以同時(shí)檢測多種熒光，因此可以進(jìn)行多重檢測，即在同一個(gè)反應(yīng)體系中，將不同探針標(biāo)記上不同的熒光基團(tuán)，這樣就可以同時(shí)檢測多種疾病的病原，這也是疫病診斷的一個(gè)研究方向。Risatti等（2003，2005）建立了一種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測CSFV，并與病毒分離作了比較，證明其敏感性高于病毒分離（100%/72.4%），特異性略低于病毒分離（98.9%/100%）。日本學(xué)者Ophuis等（2006）應(yīng)用熒光定量RTPCR方法對(duì)攻毒豬各組織臟器中的病毒進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早在攻毒后1 d就在扁桃體中檢測到了病毒的存在。Cho等應(yīng)用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的兩條TaqMan-MG探針建立了一種能鑒別韓國CSFV野毒株和LOM疫苗株的熒光RT-PCR方法。

2.2.3 核酸探針技術(shù) 核酸探針技術(shù)是在分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以病毒RNA基因組為模板制備探針，在cDNA合成之后，進(jìn)行Southern blot，特異的核酸探針會(huì)在不同病毒基因組cDNA上產(chǎn)生特異的條帶。此方法具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，但診斷費(fèi)用較高。此法可用于不同毒株的分離和鑒定。Cruciere等、Dable等、Colijn等利用 CSFV基因組 RNA構(gòu)建cDNA，與BVDV進(jìn)行序列分析和比較，合成了6個(gè)探針，按照它們?cè)诓《净蚪M的位置，根據(jù)特異的雜交條帶可以區(qū)別CSFV、BVDV和BDV。我國趙啟祖等研制了石門血毒P80核酸探針，可對(duì)病毒RNA進(jìn)行定量檢測，靈敏度達(dá)220 pg。核酸探針技術(shù)有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，但需要合成核酸探針，診斷費(fèi)用較高。

2.2.4 基因芯片檢測技術(shù) 基因芯片是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項(xiàng)高新技術(shù)，在基因表達(dá)譜、功能基因組、疾病基因診斷等基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中已經(jīng)顯示出重要的理論意義和廣泛的應(yīng)用前景。它被譽(yù)為又一次生命科學(xué)領(lǐng)域的革命，世界各國爭相投入研究。

基因芯片是指在一個(gè)很小的表面，通常是硅化玻璃，覆蓋上成千上萬的寡核苷酸，每一個(gè)固定在芯片上的特定位置都可以找到這個(gè)點(diǎn)，每個(gè)寡核苷酸反應(yīng)芯片上有成千上萬的拷貝互補(bǔ)信息，包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因組芯片，主要目標(biāo)是用于DNA序列的測定、病原檢測、基因表達(dá)譜鑒定、基因突變體的檢測分析，以及基因組的功能研究等。基因芯片技術(shù)為動(dòng)物疾病診斷提供了新的技術(shù)理念，出現(xiàn)可以替代傳統(tǒng)方法的新技術(shù)，并形成新產(chǎn)品。目前，我國也正在研究應(yīng)用基因芯片檢測技術(shù)來診斷豬瘟，這將對(duì)我國豬瘟的防控具有深遠(yuǎn)意義。

3 結(jié)語

我國現(xiàn)階段CSF流行形勢復(fù)雜，沒有明顯規(guī)律性，CSF仍是我國動(dòng)物疫病防制的一大難題，防控任務(wù)艱巨。在目前已有的檢測手段中，分子生物學(xué)方法高度靈敏特異，且檢測迅速，十分適合大面積檢測，有著不可替代的優(yōu)勢。分子標(biāo)記疫苗一旦成熟，血清學(xué)方法就能夠進(jìn)行鑒別診斷，ELISA方法也具有廣闊前景。基因芯片診斷技術(shù)是一種高效、靈敏和特異性好的診斷技術(shù)，在不久的將來將會(huì)廣泛應(yīng)用于豬瘟診斷。

[1]袁東波，湯德元，曾智勇.豬瘟病毒的分子結(jié)構(gòu)及其新型疫苗研究[J].世界農(nóng)業(yè)，2008，（1）：59-62.

[2]蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)（第四版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：147-153.

[3]張淑霞，楊增岐，張衛(wèi)軍，等.豬瘟熒光抗體的制備及其在自然感染病例中的應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)報(bào)，2006，（26）：251-253.

[4]劉建柱，崔玉東，樸范澤.豬瘟診斷方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（2）：32-35.

[5]周宗元，方 元，顧志香，等.應(yīng)用HRP-SPR-ELISA檢測 CSFV 抗體的研究[J].獸醫(yī)大學(xué)報(bào)，1987，7（4）：391-396.

[6]余興龍，涂長春，李作生，等.以重組mE2蛋白為抗原建立檢測CSFV抗體間接ELISA方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21（3）：220-222.

[7]陸芹章，羅廷榮，溫和心，等.CSF單克隆抗體的制備及ACI-ELISA檢測CSFV的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26（5）：50-54.

[8]陳振海，王 琴，范學(xué)政，等.CSFV E0蛋白的原核表達(dá)及其間接ELISA方法的建立[J].中國病毒學(xué)，2005，20（2）：135-139.

[9]CHOI K S，KO Y J，NAH J J，et al.Monoclonal antibody 2 based competitive enzyme-linked immunos-orbent assay fordetecting and quantifying west nile virus 2 neut ralizing antibodies in horse sera[J].Clin Vaccine Immunol，2007，14（2）：134-138.

[10]梁冰冰，孫 元，彭伍平，等.豬瘟病毒中和抗體競爭抑制ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（11）：957-961.

[11]Risatti G， Holinka I， I U Z，et al.Diagnostic evaluation of a real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of classical swine fever virus[J].J Clin Microbiol，2007，（9）：468-471.

[12]趙建軍，成 丹，李 娜，等.豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的建立及其對(duì)人工感染豬體內(nèi)豬瘟病毒的檢測[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（7）：685-693.

[13]Cho H S，Park S J，Park N Y.Development of a rever-transcription polymerase chain reaction assay with fluorogentic probes todiscriminate Korean wild type and vaccine isolates of classical swine fever virus[J].Can J Vet Res，2006，（70）：226-229.

[14]楊 林，李守軍，張桂紅，等.豬瘟病毒檢測用寡核苷酸芯片探針的篩選[J].中國獸醫(yī)雜志，2007，43（1）：15-17.