酶抑制-比色法在農藥殘留快速檢測中的研究進展

杜美紅，孫永軍，汪 雨，陳舜琮

(北京市理化分析測試中心，北京 100089)

酶抑制-比色法在農藥殘留快速檢測中的研究進展

杜美紅，孫永軍，汪 雨，陳舜琮

(北京市理化分析測試中心，北京 100089)

概述酶抑制-比色法在農藥殘留快速檢測中的檢測原理、對不同種酶源的選擇與保存、酶抑制法檢測條件及改進方法等研究進展，并指出酶抑制-比色法在使用中存在的問題和未來的發展趨勢。

酶抑制法；農藥殘留；快速檢測；比色法；有機磷類；氨基甲酸酯類

蔬菜中的農藥殘留問題近年來成為輿論焦點，同時也引起了政府的關注[1-3]。但是蔬菜是種特殊的農產品，其保鮮時期很短，流通環節不宜過長，如果用常規的檢測方法，沒等檢測完畢，蔬菜就已經失去了食用價值。另外，這類農產品農藥殘留問題較多、較嚴重，易引發急性中毒事件，因此用于檢測蔬菜、水果中的有機磷、氨基甲酸酯類農藥的酶抑制法快速檢測技術備受重視[4-6]。

1 酶抑制法檢測原理

酶抑制法是研究最多且相對成熟的一種對部分農藥殘留進行快速檢測的技術[7-9]。我國已將其列入國家標準GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測》中作為農產品中農藥殘留的快速檢測方法。該法測定有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留具有快速、簡便、靈敏及成本低等優點，深受廣大基層監督部門、生產基地及市場的歡迎[10-11]。

其主要原理是在一定的條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農藥對膽堿酯酶催化水解的功能有抑制作用，其抑制率與農藥的濃度呈正相關。利用這一特性，在酶反應實驗中加入底物和顯色劑觀察顏色的變化或測定酶與某種特定化合物反應的物理化學信號的變化，可判斷有機磷或氨基甲酸酯類農藥是否殘留。這種利用酶抑制產生顯色反應，通過分光光度計比色測定有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的方法稱為比色法。

2 不同種酶源的選擇與保存

酶源選擇是酶抑制法應用的基礎，其性質好壞、特異性大小、穩定性強弱直接關系檢測結果。不同種類、不同來源的酶源，對檢測靈敏度的影響有較大差異。檢測技術中應用的酶，既有來源于動物的也有來源于植物的，并且所提取的方法也不相同。

2.1 動物酶源

動物酶源應用廣泛，由于方法本身對酶純度要求不太高，因此，一般方法提取的酶液便可滿足需要[12-13]。王小瑜等[14]以商品乙酰膽堿酯酶(來自家蠅)和自制的雞肝乙酰膽堿酯酶(AChE)、鯉魚腦AChE為研究對象，比較3種不同濃度的有機磷農藥(氧化樂果、敵百蟲和敵敵

畏)對這3種酶的酶活力抑制率。結果表明，3種農藥對家蠅AChE的抑制率最高；對雞肝和鯉魚腦AChE的抑制率比家蠅AChE低；3種AChE對氧樂果都不敏感。張慧君等[15]以商品AChE和自制雞肝酶為農藥檢測用酶，比較了不同濃度的敵敵畏、敵百蟲、馬拉硫磷和西維因對這兩種酶的抑制情況。結果表明，雞肝酶的AChE酶活力較低，而其總酯酶活力對4種農藥的靈敏度與商品AChE活力的靈敏度相近，且總酯酶活力對除馬拉硫磷外的其余3種農藥的檢出限都較AChE低。同時對總酯酶活力測定的pH值進行了優化，發現pH6.5時總酯酶活力較高。王學貴等[16]運用酶抑制-比色法，以菜青蟲AChE作為實驗酶源，測定了四川雅安地區的四季豆、生菜、鳳尾等5種蔬菜中氧化樂果的殘留量。Valdés-Ramirez等[17]選用電鰻電器官、基因重組果蠅(B394)及野生果蠅提取的AChE分別進行靈敏度比較實驗，結果發現基因重組果蠅(B394)所提取的AChE 檢測敵敵畏的檢測限為7×10-11mol，野生果蠅所提取的AChE檢測限為1× 10-8mol，電鰻電器官所提取的AChE檢測限為6×10-6mol。余孝穎[18]用酶電極法研究了有機磷農藥對3種不同生物來源的AChE的選擇性抑制，發現敵敵畏對家蠅的AChE抑制最強，電鰩AChE次之，雞肝AChE陽性弱反應，同時研究了5種農藥對電鰩AChE的選擇性抑制能力，發現9.8×10-8mol/L辛硫磷即可抑制其活性的10%。

2.2 植物酶源

植物酯酶檢測農藥殘留可以達到與動物膽堿酯酶相當的準確度和精密度。植物酯酶酶源豐富，取材方便，在農藥殘留快速檢測中應用前景更加廣闊。李治祥等[19]應用植物酯酶的抑制技術，測定蔬菜水果中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的簡易薄層-植物酶抑制(TLC-EI)法。該法對多種農藥的最小檢出量為納克級，最小檢出質量濃度為0.01mg/L，添加回收率在80%以上。黃志勇等[20]在通過正交試驗優化膽堿酯酶與植物酯酶的測定條件下，比較對蔬菜中有機磷農藥殘留的測定，其加標回收率都在85%以上。但植物酯酶法測定結果較好，精密度為3%。林素英等[21]研究了各種不同豆類來源酯酶對有機磷農藥的敏感性得出綠豆、黑豆來源酯酶的總酯酶活力和敏感性最好。朱霞萍等[22]基于α-乙酸萘酯和固藍B在面粉酶的催化作用下生成紫紅色的偶氮化合物，而有機磷農藥在雙氧水的活化下會抑制酶的催化作用，其抑制程度與農藥的濃度在一定范圍內呈線性關系，由此建立了一種快速測定有機磷農藥的方法。探討了最佳的反應條件，測定甲基對硫磷和甲胺磷的線性范圍分別為l～10μg/mL和l～50μg/mL，最低檢出限分別為0.1136、0.3525μg/mL。溫艷霞等[23]證實有機磷農藥殘留檢測最佳的植物酯酶來源為黃豆種子，不僅總酯酶含量高而且對敵敵畏、對硫磷、久效磷等幾種農藥殘留最低檢測限可達到我國或歐盟規定的最低允許殘留量標準的要求。穆隨選等[24]通過對6種木本植物的總酯酶活力、比活力、農藥敏感性和最低檢測限的測定，得出國槐的總酯酶活力是小麥的1.53倍，刺槐總酯酶活力是小麥的2.036倍，比活力是小麥的1.17倍，而側柏、灑金柏、杜仲和臘梅酯酶總活力和比活力均低于小麥，實驗表明刺槐為適宜的植物酶源。康天放等[25]為了快速檢測蔬菜中的有機磷農藥殘留狀況，分別從京9428、京9583、京東8A、京2小麥中提取植物酯酶，將這些酶用于有機磷農藥的檢測，采用分光光度法比較了不同質量濃度對硫磷對小麥酯酶活力的抑制情況：結果表明，不同品種小麥酯酶對于對硫磷的敏感度不同，在所研究的小麥酯酶中，京2酯酶對對硫磷最為敏感，其檢測限達到3.0×10-7mg/L。于基成等[26]利用酶抑制法快速檢測蔬菜中有機磷農藥殘留，以小麥為對照，比較了大豆、玉米、綠豆等10種植物中植物酯酶活性，優化了植物酯酶提取條件。同時系統地研究了酶促反應條件，建立了酶抑制法快速檢測蔬菜中有機磷農藥殘留的方法。研究結果表明，以綠豆中提取的粗酶酶活力最高，提取條件為：以0.1mol/L pH值為6.2的磷酸緩沖液為提取劑，按固液比1:5(m/V)加料，在40℃攪拌20min，過濾。最佳酶促反應條件為：反應體系0.1mol/L pH6.0磷酸緩沖液、反應時間15min、反應溫度40℃、顯色時間10min、測定波長520nm處吸收峰值；樣品提取用含10%乙醇的0.1mol/L pH6.4的磷酸緩沖液超聲波振蕩10min；方法的回收率為86.7%～97.1%，最小檢出限為0.13～0.24 μg/mL。錢立立等[27]用電動流動分析和酶抑制法測定池塘水中有機磷和氨基甲酸酯農藥殘留折合總量。酶抑制法用面粉酯酶，有機磷和氨基甲酸酯農藥作酶抑制劑，底物的酶解產物與顯色劑反應，用分光光度計在波長524nm處檢測。有機磷和氨基甲酸酯農藥的折合濃度對數線性范圍為0.02～0.20mg/L氧化樂果，檢出限為0.01mg/L氧化樂果，每小時可測24個樣品。氨基甲酸酯在80℃完全水解，而有機磷部分水解，據此可判斷農藥類別。

2.3 微生物酶源

在一些文獻中也有采用微生物作為酶源的，如Walz等[28]從鐮刀菌pisi中提取角質酶，利用酶抑制分光光度法和96孔板法同時檢測多個樣品中有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的含量，該法對毒死蜱和對氧磷的檢測限分別為2.6mg/L和0.04mg/L。

2.4 保存及穩定性

目前，國內市場上農藥殘留檢測酶試劑主要有凍干工藝生產的固態酶和傳統工藝生產的液態酶兩種，為了提升保存的質量不少研究人員對其保存條件及保護劑做

了大量研究。周艷利等[29]對大豆酶穩定性的研究得出在4℃保存30d，酶活力損失較少；在－20℃保存30d，完全失活；在50℃以下，pH值在6.0～9.0保存10min，酶活力無明顯變化；保護效果好的保護劑依次為牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖和甘油。周艷明等[30]利用冷凍干燥方法并在干燥過程中加入5%的聚乙二醇可以有效的保護酶制劑不失活，植物酶干粉在室溫下保持一個月以后仍能表現出良好的穩定性。蔡琪等[31]通過添加2%正丁醇、5%蔗糖、1%動物血清白蛋白及自制高效保護劑，在保持所研制的農藥殘留檢測膽堿酯酶高檢測靈敏度的前提下，使該液態酶試劑的保存性得到很大提高，冷藏條件下可長期保存，室溫保存15d酶活性無明顯下降，37℃高溫條件下放置2周仍能保持60%以上的酶活性。

3 酶抑制法檢測條件

酶是一種生物催化劑，其反應速度受溫度、pH值、環境中離子、酶抑制劑等因素影響，一方面應盡量避免環境因素的影響，另一方面也要開發改良反應體系。

3.1 酶反應最佳條件

影響測定誤差大小的因素很多，諸如酶和底物來源及濃度，反應溫度、pH值和反應時間等，因此其重現性不佳。李順等[32]通過正交試驗和極差分析得出酶抑制法快速檢測蔬菜中有機磷農藥殘留的最佳檢測條件為：抑制時間15min、抑制溫度35℃、底物加入量100μL、酶液加入量100μL。董杰等[33]對利用家蠅頭部AChE檢測有機磷殘留量探索了最佳條件，其研究結果表明：家蠅初羽化至羽化后第15天，其頭部AChE的酶活力逐漸升高((0.4483±0.0104)～(0.7769±0.0189)μmol/(mg·min))，而酶源蛋白質的含量逐漸下降((187.0222±9.0213)～(83.0222±7.1111)μg/頭)。羽化后2～4d，其頭部AChE的敏感度最高；初羽化和羽化后第15天，敵敵畏的IC50分別是羽化后第3天的1.4倍和2.1倍。在一定的pH值范圍內(6.6～8.0)，家蠅頭部AChE的酶活力隨緩沖液pH值的升高而增大。王文祥等[34]研究了磷酸緩沖液pH值、反應時間、反應溫度、底物、酶用量對兔血清AChE活力測定的影響，結果表明，供試AChE活力最佳條件是：磷酸緩沖液(pH8.0)3.0mL、顯色劑0.6%二硫雙對硝基苯甲酸(DTNB) 50μL、0.75%酶液(pH8.0)100μL、反應溫度35℃。混勻穩定后加入底物l%碘化硫代乙酰膽堿(BTCI)50μL。反應l80s后在波長412nm處測定光密度。在上述條件下，測定結果表明有機磷殺蟲劑丙硫磷(prothiofos)質量濃度在0.0125～0.4g/mL，保育時間5～30min與AChE抑制率之間存在良好的相關性，可根據檢測需要調整保育抑制時問。楊東鵬等[35]提出了新的最適條件確定標準，即保證酶的活性保持在一定水平的基礎上(0.1333min-1≤k1≤2667min-1)，選擇抑制率(以甲胺磷為抑制劑)最高時的溫度和pH值作為最適條件。確定了抑制時間為10min時的最適條件為：抑制溫度47.0℃，pH7.7。進而在此最適條件下確定了新的檢測結果判斷標準：當酶抑制率≥58%時，蔬菜中含有某種有機磷或氨基甲酸酯類農藥殘留為陽性。裘正軍等[36]通過單因素對比試驗研究了吸光度隨反應時間的變化關系、溫度對酶活性的影響及農藥殘留濃度與酶抑制率的關系。結果表明吸光度隨反應時間逐漸增加，反應前期增速快，線性度好，適合測量；酶在20～40℃時具有最佳的活性，靈敏度高；農藥殘留對酶的抑制作用明顯，當抑制率高于70%時可判定農藥殘留超標。張叔平等[37]為快速檢測農藥殘留，建立了一種快速檢測方法——酶抑制率法，確立了最優化條件，得出了普遍公式，根據我國國家標準允許殘留限量可知其對應的抑制率閾值。

3.2 酶反應體系及底物

酶抑制劑顯色反應可使用的底物和顯色劑很多，不同的酶與底物配合使用，其檢測限不盡相同。劉文君等[38]對酶抑制法常用的底物2,6-二氯靛酚乙酸酯和固蘭B鹽進行比較實驗，結果表明：2,6-二氯靛酚乙酸酯較固蘭B鹽更優越，更適合于有機磷農藥的快速現場檢測。2,6-二氯靛酚乙酸酯作為底物的優越性主要表現在：與生成物有良好的穩定性；植物酯酶的反應條件較為協調合理；敵敵畏對植物酯酶的抑制率與農藥濃度對數值呈良好的線性關系；用添加農藥法測定的回收率較高。侯學文等[39]利用膽堿酯酶水解碘化酰膽堿后形成的硫代膽堿，與二硫雙對硝基苯甲酸發生化學反應生成黃色產物，在波長412nm處比色測定。利用此法測定酶、底物的添加量以及保溫溫度和保溫時間對酶活力的影響，還研究了不同濃度與保溫時間的辛硫磷對膽堿酯酶活力的抑制情況。獲得了膽堿酯酶優化的反應條件，結果表明膽堿酯酶對辛硫磷比較敏感。周和喜[40]利用速測卡中的膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯(紅色)水解為乙酸與靛酚(藍色)。而有機磷或氨基甲酸酯類農藥則對膽堿酯酶有抑制作用的特點，通過顏色變化，判斷樣品中是否存在高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥。劉偉[41]采用高靈敏度的乙酰膽堿酯酶-硫代黃素T體系作為識別元素，在此體系中加入有機磷農藥后，AChE -硫代黃素T體系特征熒光峰發射峰(波長490nm)被猝滅，熒光猝滅強度與農藥濃度存在線性關系，因此可以直接確定農藥濃度。宛梅丹等[42]建立乙酸靛酚酯-丁酰膽堿酯酶法農藥殘留快速檢測反應體系比傳統的膽堿酯酶-碘化硫代乙酰膽堿法測定步驟更簡便，保溫所需時間更短。劉暢等[43]以二次鹽析后的鴨血清丁酰膽堿酯酶(BchE)為農藥殘留的檢測用酶，碘化硫代丁酰膽堿(BTChI)為底物，5-5'-二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)為顯色劑，410nm波

長處比色測定吸光度變化，計算膽堿酯酶的抑制率，從而推算農藥殘留情況。當抑制率大于35%時，表明農藥含量超標。檢測過程只需20～40min，并可同時檢測多個樣品。

4 其他改進方法

4.1 增敏

在生物體外，有許多農藥是酶的弱抑制劑，因此需要使用適當的轉化劑，使其變成酶的強抑制劑。趙永福等[44]采用植物酯酶抑制法測定了蔬菜中農藥的殘留，研究了陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉對顯色體系的作用。結果表明，十二烷基硫酸鈉具有顯著的增敏效果，其增敏幅度達到70%，同時對顯色劑有增穩作用。用所建立的方法測定蔬菜中殘留的敵敵畏，線性范圍為0.11～1.6mg/L，最低檢出限0.04mg/L。

4.2 前處理

除了有機磷和氨基甲酸酯類物質有可能對酶產生抑制作用外，食用植物中某些氯代煙堿類似物質對AChE也有一些抑制作用，因此檢測過程可能出現假陽性。桑園園等[45]選用實際檢測中易出現假陽性現象的韭菜、蒜苗、蒜黃、大蒜4種蔬菜為材料，利用酶抑制法檢測農藥殘留，并對樣品前處理步驟進行改進，增加了對樣品提取液加熱處理，達到消除假陽性的目的。結果表明，對樣品提取液進行適當加熱可以起到消除假陽性的作用，且不會造成殘留農藥的損失。蒜苗、蒜黃、大蒜、洋蔥的最佳處理溫度分別為110、100、120、80℃，在達到相應最佳消除溫度后，假陽性影響消失，且加熱時間對假陽性影響不顯著。王琳玲等[46]研究了萃取技術對酶抑制效果的影響，結果表明，利用亞臨界水萃取技術在萃取溫度70℃，萃取時間5min，提取液pH8.0，提取液體積為5mL的條件下，滅多威有最高萃取效率。黃永春等[47]對現存農藥快速檢測技術中提取效率問題進行研究，當添加農藥后的時間間隔為2h時，添加的農藥主要以簡單吸附持留在蔬菜表面，80%～98%的添加農藥可以被提取出來，隨著時間間隔的延長(至5h)，采用表面沖洗的農藥提取效率急劇下降，大部分農藥的提取效率為20%～60%，簡單表面沖洗法在實際應用中很難將蔬菜中殘留的農藥提取出來。馮國棟等[48]開發出一種用于大米、面粉、水果、蔬菜等樣品中有機磷和氨基甲酸酯類農藥的現場快速前處理方法和化學試劑盒。并且討論了影響現場快速檢測的主要因素，對大多數有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢出下限可達0.1～3.0mg/kg。王琦[49]在不同條件下分別處理油菜、甘藍、蘋果上的甲胺磷和氧化樂果農藥殘留，確定了不同處理劑的去農藥殘留效果和較佳處理條件。與此同時，測定不同處理劑在不同處理條件下對油菜、甘藍、蘋果營養品質的影響，以最終確定最佳處理條件。鐘樹明等[50]應用植物酶抑制技術檢測蔬菜中的有機磷及氨基甲酸酯類農藥。用小柱對樣品進行預處理，可去除葉綠素的干擾、提高檢測靈敏度。提出了抑制率閾值(15%)。應用此方法對市售蔬菜的農藥殘留進行調查，檢出率約為10%。

5 問題與展望

綜上所述，盡管酶抑制-比色法在快速檢測農藥殘留中有廣泛應用，但它仍然存在一些問題。由于酶結構的復雜性和多樣性，即使同樣酶源的酶在不同生產批次對同種農藥也會出現一定差異，而且同一批次的酶對不同種農藥的靈敏度也有很大差異，所以容易出現假陽性或假陰性。由于比色法檢測以吸光度變化計算相應酶的抑制率，植物體的內容物如氧化酶次生物質葉綠素、花青素等必然會對酶反應產生干擾，檢測液的顏色會有變化，導致檢測結果專一性、準確率、可比性等都存在問題。

農藥殘留快速檢測是一件嚴肅認真的工作，不僅需要可靠的儀器及方法更需要規范的操作和健全的制度。隨著各類技術縱向的發展與橫向的聯用，農藥殘留快速檢測中的瓶頸問題勢必會得到解決。

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Advances in the Application of Enzyme Inhibition/Colorimetric Assay to the Rapid Detection of Pesticide Residues

DU Mei-hong，SUN Yong-jun，WANG Yu，CHEN Shun-cong
(Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

This paper summarizes the principles of enzyme inhibition/colorimetric assay, sources and preservation of enzymes used in the assay and enzymatic reaction conditions. In addition, the problems encountered during its application and the future development trends are pointed out.

enzyme inhibition；pesticide residues；rapid detection；colorimetry；organophosphoms；carbamates

TS207.3

A

1002-6630(2010)17-0462-05

2010-06-29

國家科技部專項“科學儀器設備質量評價體系構建”項目(2009IM033200)

杜美紅(1974—)，女，助理研究員，博士，研究方向為食品安全分析檢測。E-mail：dumeihong@hotmail.com