應用重組改良型人膜聯蛋白評估兔動脈粥樣硬化病變程度的實驗研究

宋麗萍，華子春，張 欣，軒 楠，邢海燕

（1.遼寧醫學院附屬第一醫院核醫學科，遼寧 錦州 121000；2.南京大學醫藥生物技術國家重點實驗室，江蘇 南京 210093）

急性冠狀動脈綜合征的發生常與一些不穩定冠狀動脈粥樣斑塊及繼發血栓密切相關。這些斑塊常常并不導致嚴重的管腔狹窄，卻容易發生破裂、糜爛、鈣化等情況而易于繼發血栓。因此，及時發現并干預不穩定斑塊，是防治急性心血管事件的關鍵。大量文獻報道，細胞凋亡在動脈粥樣硬化的發生發展中起到非常重要的作用，而膜聯蛋白V（Annexin V）可與凋亡早期細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸（phosphatidyserine，PS）特異性結合[1]。因此，用99mTc標記Annexin V可進行動脈粥樣硬化（AS）病變的細胞凋亡顯像的研究。重組改良型人膜聯蛋白（H-Annexin V）是南京大學新藥生物技術國家重點試驗室對Annexin V進行重組技術的基礎上，將Annexin V的N端接入一段10個組氨酸（Histidine）結構的多肽，從而構建內源性锝鰲合位點[2]，并不改變Annexin V的生物活性，同時又可提高其與99mTc結合效率及穩定性。因此，本研究就是通過99mTc直接標記 HAnnexin V，探討99mTc-H-Annexin V檢測兔AS病變的價值。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物：健康雄性大耳白兔9只，體重2.5~3.5kg，均由遼寧醫學院動物實驗中心提供。

試劑H-Annexin V由南京大學新藥生物技術國家重點試驗室提供。99mTcO4-由北京原子高科核技術有限公司提供。其余試劑均為國產分析純。

儀器SPECT為GE公司生產的infinia II雙探頭可變角度帶符合線路的SPECT。GC-911型γ計數器為合肥中佳光電儀器公司。

1.2 方法

兔AS斑塊模型的制備：9只雄性大耳白兔，體重2.5~ 3.5kg。隨機分為球囊損傷組、單純高脂飼料組和正常對照組，每組各3只。

球囊損傷組給與高脂飲食 （內含2%的膽固醇和5%豬油）飼養2周后，10%水合氯醛（3ml/kg體重）靜脈注射麻醉動物，腹股溝區觸摸股動脈搏動，縱向切開皮膚，分離皮下組織，鈍性分離股動脈、靜脈和神經。切開股動脈，球囊導管插入股動脈，上行插入約30cm后，給球囊注入生理鹽水0.2ml，向下拖拉球囊至髂總動脈分叉處，反復3次。縫合動脈切口和皮膚，青霉素80萬單位腹腔注射3天，防止感染。術后繼續給予含2%膽固醇和5%豬油的高脂飼料，15周后進行主動脈在體和離體顯像。單純高脂飼料組給予內含2%的膽固醇和5%豬油的飼料，飼喂15周。正常對照組給予普通飼料喂養15周。

99mTc-H-Annexin V的制備：取凍干品H-Annexin V 500μg以生理鹽水溶解，加入緩沖液 （50mm PBS，140mm NaCl，5%甘油，pH值為7.6），再加入約40μg還原劑SnCl2，然后在其中加入37~55.5MBq/kg99mTcO4-進行直接標記，混勻，條件均為常溫下震蕩，37°孵化25min，取出自然冷卻到室溫。

99mTc-H-Annexin V標記率的測定：采用紙層析法測定標記率，取標記混合物用新華1號層析紙，丙酮作展開劑，點樣后上行展開一段距離，取出晾干，然后從原點下0.5cm開始，每間隔1cm將層析紙分段剪裁，用γ計數器測定各段放射性并計算比活度。

99mTc-H-Annexin V活體兔AS斑塊顯像：3組兔飼喂15周后進行顯像。以10%水合氯醛（3ml/kg體重）麻醉兔后固定，自耳緣靜脈注射99mTc-H-Annexin V 37~55.5MBq/kg。注射后10、30min和1、2h行靜態平面前后位顯像。顯像儀器為美國GE公司生產的infinia II雙探頭可變角度帶符合線路的SPECT/CT儀，配低能高分辨型準直器，能峰140keV,窗寬20%。矩陣128×128，放大倍數2.0。視野包括腹主動脈、部分肝脾、雙腎和膀胱。并計算2小時球囊損傷組和高脂飼料組兔降主動脈靶/非靶（T/NT）比值。

兔AS斑塊離體血管顯像及血管片段放射性測定：球囊損傷組和高脂飼料組兔活體顯像后，注射過量的10%水合氯醛處死動物，進行解剖。小心暴露動物心臟與髂總動脈分叉之間的胸腹主動脈，清除附著于動脈上的脂肪與組織，取出降主動脈。沿腹側縱向剪開動脈壁，以生理鹽水沖洗干凈后置于離體的血管按斑塊的分布剪成若干等份，每段血管用電子天平稱質量并用γ計數器測定放射性計數，計算每毫克組織放射性強度（cpm/mg）。

病理結果：將離體血管標本經石蠟包埋、切片，行HE染色，在光學顯微鏡下觀察。

統計學處理：采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，所有數據用±s表示，T/NT及AS斑塊的血管片段放射性攝取的比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AS模型的制備

經球囊損傷血管內皮及高脂飲食后，15周后球囊損傷組AS模型制備成功。光學顯微鏡下可見纖維帽形成，脂質壞死中心，細胞外基質及平滑肌細胞很少（圖1）。

單純高脂飼料組AS模型：光學顯微鏡下可見病變血管壁內膜增厚，內膜下泡沫細胞堆積，平滑肌細胞和基質增多（圖2）。

2.2 99mTc-H-Annexin V的標記結果

標記率為95.23%~96.15%，平均為95.82%±0.28%。

2.3 兔AS活體核素成像結果

顯像劑注射后10min球囊損傷組兔降主動脈可見放射性攝取，隨著時間的延長，顯像劑攝取增加，顯像劑注射后2h，球囊損傷組兔降主動脈顯影最為清晰。單純高脂飼料組兔在注射顯像劑后10min可見降主動脈放射性攝取，隨著時間的延長，顯像劑攝取逐漸增加，注射顯像劑后2h，仍可見降主動脈影像。而正常對照組兔在注射后10min可見主動脈顯影，但隨著時間的延長，放射性逐漸消退，2h主動脈顯影不清晰。注射顯像劑后2h球囊損傷組T/NT比值（2.68±0.25）明顯高于單純高脂飼料組（2.08±0.18，t=3.26，P＜0.05）和正常對照組（1.57±0.24，t=5.44，P＜0.01）（圖4~9）。

2.4 離體血管顯影結果

注射99mTc-H-Annexin V后2h處死球囊損傷組和高脂飼料組兔，解剖出主動脈，肉眼可見主動脈內膜面大小不等的淡黃色斑塊樣突起。離體顯像可見：球囊損傷組影像較為清晰，而單純高脂飼料組可見降主動脈顯影，但影像欠清晰。球囊損傷組含 AS斑塊的血管片段放射性攝取為 63.33± 14.11cpm/mg，明顯高于單純高脂飼料組含AS斑塊血管片段的放射性攝取52.08±12.39cpm/mg（t=2.17，P＜0.05）（圖10~12）。

圖10 球囊損傷組離體動脈標本顯像。 圖11高脂飼料組離體動脈標本顯像。 圖12 正常對照組離體動脈標本顯像。Figure 10. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis in vitro imaging of the balloon traumatic group. Figure 11. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis in vitro imaging in high fat diet group. Figure 12. The abdominal aorta in vitro imaging in normal control group.

3 討論

人膜聯蛋白是鈣離子依賴的磷脂結合蛋白——Annexin家族成員之一，廣泛分布于機體的各種組織中，具有很多重要的生理功能。Annexin與PS具有高度親和力，一旦細胞凋亡發生，PS就快速地再分布于細胞膜表面。凋亡開始后Annexin V與細胞的結合位點可增加100~1000倍左右，因而Annexin V是細胞凋亡非常敏感的指標[3]。由此，放射性標記的Annexin V最早被研制成細胞凋亡顯像劑，用于活體監測及定量測定細胞凋亡。在動脈粥樣硬化斑塊組織中，內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞及淋巴細胞都存在著凋亡現象。而細胞凋亡與不穩定斑塊密切相關，但有研究顯示在動物早期的動脈內膜病變中，發現了平滑肌細胞的增殖和凋亡[4]。由于動脈粥樣硬化病變的不同階段存在的凋亡細胞數量不同，因此用放射性核素標記的Annexin V可進行動脈粥樣硬化病變程度的評估。Johnson等[1]報道，99mTc-Annexin V在豬動脈粥樣硬化模型中顯示冠狀動脈的斑塊，免疫組化結果提示，病變動脈段的細胞凋亡率明顯高于周圍正常動脈段及對照組的動脈段。同時，Buck等[5]體外放射性核素顯像表明，99mTc-Annexin V的攝取量與主動脈粥樣硬化部位血管損傷的嚴重程度、巨噬細胞凋亡的數量成正相關。

動脈粥樣硬化模型的制備方法有很多，由于家兔在脂代謝方面與人類有一些相似之處，是研究AS常選的實驗動物。采用單純高脂飼料喂養兔誘發AS的實驗模型，數月就能形成早期的AS病變[6]。而通過球囊損傷動脈并給予高脂飲食可造成不穩定斑塊模型[7]。本實驗單純高脂飼料組AS模型在光學顯微鏡下可見病變血管壁內膜增厚，內膜性泡沫細胞堆積，平滑肌細胞和基質增多，為AS早期病變。球囊損傷組兔經球囊損傷血管內皮及高脂飲食后15周在光學顯微鏡下可見纖維帽形成，有大量的脂質壞死中心，而細胞外基質及平滑肌細胞很少。根據美國心臟病協會將動脈粥樣硬化的組織形態學變化分型可知，球囊損傷組兔動脈粥樣硬化模型為晚期病變纖維粥樣斑塊期。

有研究報道：多種核素曾被用于標記Annexin V，包括99mTc、123I、124I、125I、18F等，而99mTc制備容易、 價格低廉， 適合SPECT顯像[8-9]。然而，直接用99mTc標記的Annexin V將產生一些變性蛋白，且標記率較低。以HYNIC結合放射性核素的方式標記率高，但標記過程較直接標記法復雜，腎臟的攝取高。H-Annexin V是在Annexin V的生物結構中尋找活性區域并進行克隆得到的保持甚至于超過Annexin V生物活性的一種多肽，既保持了Annexin V對于PS的強親和力，又引進了更多的結合位點，提高了其與99mTc的結合效率及穩定性，而且標記方法更加簡單，穩定性好[10]。

因此，本研究嘗試應用99mTc標記重組改良型H-Annexin V進行兔AS病變程度評估的顯像研究，可見球囊損傷+高脂飼料組AS血管對99mTc-H-Annexin V的攝取明顯高于單純高脂飼料組及正常組的血管，顯像結果良好。AS血管標本的離體顯像及其片段的放射性攝取測定顯示：球囊損傷組影像較為清晰，而單純高脂飼料組可見降主動脈顯影，但影像欠清晰。球囊損傷組含AS斑塊的血管片段放射性攝取明顯高于單純高脂飼料組含AS斑塊血管片段的放射性攝取。說明隨著動脈粥樣硬化病變程度的加重，AS部位細胞凋亡增多，病變部位99mTc-H-Annexin V的攝取也明顯增加，因此，99mTc-H-Annexin V可用于無創檢測AS斑塊并評估病變的嚴重程度。

[1]Johnson LL,Schofield L,Donahay T,et al.99mTc-Annexin V imaging for in vivo detection of atherosclerotic lesions in porcine coronary arteries[J].J Nucl Med,2005,46:1186-1193.

[2]Bogdanoc A,Simonova J,Weissleder R.Design of metal binding green fluorescent protein variants[J].Biochem Biophys Acta,1998, 1397:56-64.

[3]蘭曉麗，張永學，安銳，等.人膜聯蛋白V的表達及核素標記[J].華中科技大學學報，2005，34（5）：520.

[4]Best PJ,Hasdai D,Sangioorgi G,et al.Apoptosis.Basic concepts and implications in coronary artery disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999,19:14-22.

[5]Buck AK,Halter G,Schinmeister H,et al.Imaging proliferation in lung tumors with PET[J].J Nucl Med,2003,44(9):1426-1431.

[6]王曉花，章建程.動脈粥樣硬化動脈模型研究進展[J].海軍醫學雜志，2007，28（2）：175-177.

[7]Rekhter MD,Hicks GW,Brammer DW,et al.Animal model that mimics atherosclerotic plaque rupture[J].Circ Res,1998,83: 705-713.

[8]Lahorte CM,Vanderheyden JL,steinmetz N,et al.Apoptosis-detecting radioligands:current state of the art and future perspectives[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2004,31:887-919.

[9]Zijlstra S,Gunawan J,Burchert W.Synthesis and evaluation of a18F-labelled recombinant annexin-V derivative,for identification and quantification of apoptotic cells with PET[J].Appl Radiat Isot,2003,58:201-207.

[10]賈支俊，馮雪鳳，楊翔，等.99Tcm-H-Annexin V動物體內分布及顯像[J].中國臨床醫學影像雜志，2008，19（1）：56-57.