HIF-1 α基因修飾 NSCs后作用機制探討

金玉玲,陸曉紅,綦 瑩,羅海龍,吳盛華,陸春風

(1.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003;2.哈爾濱市兒童醫院,黑龍江 哈爾濱 150000;3.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院,黑龍江 牡丹江 157006;4.佳木斯市中心醫院,黑龍江 佳木斯 154002)

NSCs攜帶外源基因治療為神經系統疾病變的治療及機制探討提供了廣闊的前景[1],為揭示神經系統中各種轉錄因子作用相關機制等問題提供了良好的實驗模型。擴增 AdHIF-1α--GFP后轉染 NSCs,免疫細胞化學染色法檢測轉染后 N SCs基因表達情況、V EGF和 NF-κ B的表達情況及給予梯濃度 N F-κ B特異性抑制劑 PDTC后 AdHIF-1α--GFP修飾后 NSCs中 VEGF的表達情況。從而進一步認識HIF-1α在 CI后信號轉導途徑 ,為深入了解 NF-κB在發揮腦保護效用中的作用機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑

DMEM/F12、B27(為 Gibico產品),人基因重組表皮生長因子(EGF)、人堿性纖維生長因子(bFGF)(為 Invitrogen產品 ),兔抗 Nestin多克隆抗體、羊抗兔 IgG-CY3、兔抗HIF-1 α多克隆抗體、兔抗 NF-κB多克隆抗體、兔抗 V EGF多克隆抗體(北京博澳森),SABC(大鼠)試劑盒,HIF-1α質粒在 Ad載體中并帶有 GFP標記 ,空載體 Ad帶有 GFP標記(由重慶醫科大學胡長林教授饋贈),HEK293-細胞33代次(北京本元正陽)。

1.2 方法

1.2.1 進行細胞培養

取新生 24h內的 Wistar大鼠,無菌取出海馬,Hanks液漂洗剪碎后吹打,用 200目篩網過濾后1000r/min離心5min,棄上清,加入完全 N SCs培養液1mL,吹打成細胞懸液,接種于細胞培養瓶中,放置37℃,5%的 CO2培養箱中靜置培養,每隔2d換液。7d后傳代,傳3代后備用。參考蔡文琴等[2]方法,采用免疫細胞化學法和熒光法進行 nestin染色鑒定是否為N SCs[3]。

1.2.2 AdHIF-1α--GFP及空 Ad--GFP的擴增

取細胞密度 70%左右 33代 HEK293細胞,PBS5mL沖洗1次;取 1mL AdHIF-1 α--GFP平鋪加入培養瓶,并左右微斜,使其均勻平鋪瓶底,放入細胞培養箱孵育2h后加入2%細胞維持液2mL孵育24h后,90%以上細胞變圓且漂浮,在熒光顯微鏡下觀察,475nm波長藍光激發光下觀察508nm的綠色熒光。并在熒光顯微鏡下成像,將細胞懸液三凍三融后5000r/5min離心,0.22濾器抽濾后分裝 EP管于-80℃冰箱凍存。采用細胞計數及 MTT方法用 Reed-Muench法計算病毒滴度及感染復數。

1.2.3 檢測基因轉染后 NSCs中 HIF-1 α表達

熒光檢測 N SCs中 AdHIF-1 α--GFP及空載體 Ad-GFP表達,分別提取基因轉染后 N SCs、空載體轉染 NSCs、正常 N SCs蛋白做免疫細胞化學染色法[4]檢測 HIF-1 α表達。

1.2.4 檢測各組 NSCs中 N F-κB和 V EGF表達

分別提取基因轉染后 N SCs、空載體轉染 NSCs、正常NSCs蛋白做免疫細胞化學染色法檢測 NF-κ B和 V EGF表達。

1.2.5 檢測給予 NF-κ B梯濃度抑制劑后基因轉染 N SCs中 V EGF表達

HIF-1α基因修飾的 NSCs中按 50μ mol/L、 150μmol/L、300 μmol/L濃度梯度加入特異性抑制劑二硫氨基甲酸酞吡咯烷(PDTC)[5],免疫細胞化學染色法檢測其中 V EGF的表達變化。

1.3 統計學方法

數據用平均數±標準差 (±s)表示 ,采用 SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析及t檢驗統計學處理。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 免疫組化檢測基因轉染后神經干細胞中 HIF-1α表達

免疫細胞化學顯示,HIF-1 α染色可見幾乎所有細胞胞漿中出現棕黃色顆粒,胞核呈藍色,構成的細胞集落形狀較規則,呈橄欖球形或球形,但未處理神經干細胞組及空載體神經干細胞組細胞中無HIF-1α染色陽性表達。

2.2 檢測各組神經干細胞中 NF-κB表達結果

見表 1。

表 1 AdHIF-1α--GFP轉染后 NSCs中 N F-κ B表達陽性細胞數比較 (±s,n=6)

表 1 AdHIF-1α--GFP轉染后 NSCs中 N F-κ B表達陽性細胞數比較 (±s,n=6)

*:與空載體組和正常組相比,P ＜0.05。

1次 2次 3次正常 NSCs 2.31± 0.20 3.65± 0.68 8.30±1.31空載體組 2.57± 0.12 3.52± 0.53 2.57±1.55基因轉染組 8.16± 1.62* 8.75± 0.96* 8.30± 1.21*F 73.37 96.09 94.36

2.3 各組神經干細胞中 VEGF表達結果

見表2。

表2 AdHIF-1α--GFP轉染后 NSCs中 VEGF表達比較 (±s,n=6)

表2 AdHIF-1α--GFP轉染后 NSCs中 VEGF表達比較 (±s,n=6)

*:與空載體轉染組及正常神經干細胞組相比較,P＜0.05。

1次 2次 3次正常 NSCs 1.83± 0.13 1.26± 0.34 1.10±0.30空載體組 1.70± 0.25 1.54± 0.36 1.36±0.37基因轉染組 9.40± 2.28* 10.57± 3.96* 10.26± 3.15*F 66.49 31.6 48.12

2.4 加入 N F-κB特異性抑制劑后 HIF-1α基因修飾的神經干細胞 V EGF的表達

見表3。

表3 轉染后 N SCs給予梯濃度抑制劑 PDTC后V EGF陽性細胞數比較 (±s)

表3 轉染后 N SCs給予梯濃度抑制劑 PDTC后V EGF陽性細胞數比較 (±s)

1次 2次 3次50 μ mol/L 19.78± 2.46 20.60± 1.65 19.42± 1.83 150μ mol/L 13.93± 1.97 14.12± 2.50 11.80± 1.52 300 μ mol/L 4.67± 0.84 7.25± 2.50 6.84± 1.48 F 97.64 74.66 91.88

300μ mol/L組與 150μ mol/L組相比 ,P＜ 0.05,有顯著差異;50 μ mol/L組 與 150 μ mol/L 組相 比,P＜ 0.05;300 μ mol/L組 與50 μ mol/L組相比P＜ 0.05。

3 討論

HIF-1α是在缺血缺氧條件下發揮重要作用的轉錄因子,一系列與組織耐受缺血缺氧環境有關的基因都由它激活轉錄[6]。我們用免疫細胞化學染色的方法顯示轉染 AdHIF-1α-GFP組有 HIF-1α陽性細胞的表達,而 Ad-GFP組和正常 NSCs組無 HIF-1 α陽性細胞的表達,在同樣的反應條件下,AdHIF-1α-GFP組 HIF-1α陽性細胞數明顯高于Ad-GFP組和正常 NSCs組。提示重組的 AdHIF-1α-GFP以轉入神經干細胞并有 HIF-1α的表達。為下一步探討目的基因 HIF-1 α的作用信號轉錄機制做了良好的鋪墊。

很多研究發現,在腦缺氧損傷區域 N F-κ B與 V EGF表達呈正相關[7]。因此,我們大膽假設,NF-κ B是否處于 HIF-1α上調 V EGF作用通路上并起重要作用。本實驗設計為以 HIF-1α修飾的 NSCs為載體,給予抑制 NF-κ B生物活性后檢測 V EGF的表達,為排除不確定的影響因素,使用國內外公認的 N F-κ B特異性抑制劑 PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸酯,pyrrolidindithiocarbamate)[8],以實現特異性抑制N F-κB表達的目的。PDTC是一種抗氧化劑,能有效抑制N F-κB活性及表達。作用原理主要通過兩方面:一是抑制N F-κ B的 p65亞單位,一是通過其金屬螯合作用。免疫細胞化學染色顯示 HIF-1α修飾的 NSCs給予梯濃度 PDTC后,VEGF陽性細胞數呈梯濃度依賴性下調,各濃度組陽性細胞表達數間有統計學差異 (P＜0.05)。符合我們最初的猜想。

本實驗通過體外培養 HIF-1α基因修飾的 N SCs,采用免疫細胞化學染色實驗方法研究 HIF-1α修飾 N SCs后各種轉錄因子表達 ,有助于我們認識 HIF-1α在 CI后信號轉導途徑,對 CI的治療有著積極而重要的指導意義。

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