水蛭素的提取及含量測定

田麗華,劉 娟,劉利成

(1.佳木斯大學藥學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學生藥學研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

水蛭素是從水蛭中提取的一種酸性多肽,在臨床上多用于治療不穩定性心絞痛(USA),急性心肌梗死(AM),血管形成術,血液透析,體外循環,腎移植(CRRT),彌漫性血管內凝血(DIC)等病癥。

天然水蛭素的分離與純化主要包括從活體水蛭素和干水蛭中分離提取水蛭素。傳統的水蛭素的獲得是對水蛭的一次性掠奪,而本實驗采用誘導方法對活體水蛭素的提取,避免了傳統方法對水蛭的一次性掠奪,保護了水蛭的野生資源,又帶動了水蛭養殖業的發展。國內曾報道了一種能利用水蛭反復吸血并用其嗉囊消化液為原料,既不殺死水蛭又能提取批量水蛭素的方法。

水蛭素的含量測定方法有多種,如生物底色法、凝血酶滴定法、光散射法、酶聯免疫法吸附測定法、同位素標記示蹤法等。本實驗采用凝血酶滴定法,1970年 Markwardt報道了凝血酶滴定法,其原理是根據水蛭素與凝血酶結合比例為1:1(mol/mol)和1:5(g/g)。凝血酶的國際單位 N IH,水蛭素的活性以抗凝血酶活力單位 ATU表示,一個 AU T等于中和一個 N IH凝血酶的水蛭素量。

1 實驗儀器、材料及試劑

本實驗所用水蛭購于山東省濟寧市,經佳木斯大學藥學院生藥學教研室主任劉娟教授鑒定。

BSZ-2型自動雙重純水蒸餾儀(上海之信儀器有限公司),5μL微量進樣器 (上海安亭微量進樣器廠),10μL微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠),酶示板。

凝血酶(北京生物制品研究所);纖維蛋白原(上海市生物制品研究所);雙重蒸餾水(自制);L-精氨酸(北京生物制品研究所);牛腸系膜 (佳木斯肉聯廠 );氯化鈉(分析純);生理鹽水(黑龍江省肇東市華富藥業有限責任公司)。

2 實驗方法

2.1 誘導法

本實驗對活體的誘導有兩種方法,一種用不同濃度的氯化鈉溶液組成的誘導系統,對活體水蛭進行誘導,收集水蛭唾液腺分泌物,測定水蛭素含量,比較結果。

另一種是用氯化鈉和 L-精氨酸組成的誘導系統,對活體水蛭進行誘導,測定水蛭素含量,比較結果。

2.1.1 不同濃度的氯化鈉溶液誘導

配制濃度為0.9%的氯化鈉溶液(即生理鹽水),分別稀釋至濃度為0.45%和0.225%的氯化鈉溶液(即1/2生理鹽水和1/4生理鹽水),裝入3個小試劑瓶里,用牛腸系膜封口組成誘導系統,對活體水蛭進行誘導,觀察水蛭的反應,收集其唾液,分別用凝血酶滴定法進行含量測定,選擇最佳誘導條件。

2.1.2 氯化鈉加 L-精氨酸誘導

配制150mm的氯化鈉溶液,分別裝于5個小試劑瓶中,分別加入 1mmol、 2mmol、 4mmol、 6mmol的 L- 精氨酸 ,用牛腸系膜封口組成誘導系統,對活體水蛭進行誘導,觀察水蛭的反應,收集其唾液,分別用凝血酶滴定法進行含量測定,選擇最佳誘導條件。

2.2 凝血酶滴定法

2.2.1 凝血酶滴定法原理

本實驗對水蛭素的含量采用凝血酶滴定法,其原理是:凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶,在止血時起中心作用,在凝血酶的分子表面有一個富含堿性氨基酸的纖維蛋白原識別位點 (FRS)。而水蛭素的 C端含有較多的酸性氨基酸,可以結合在 FRS上,阻止凝血酶與其底物血纖維蛋白原的相互作用,從而達到抗凝血的目的。

2.2.2 凝血酶滴定過程

具體方法如下:配制不同梯度(20NIH/mL,40NIH/mL,80NIH/mL,100NIH/mL)的凝血酶溶液,采用逐步縮小活性范圍,多次換管重滴的濃度梯度法,對水蛭素含量進行測定,在酶示板小孔中加200μL0.5%的纖維蛋白原(0.05mol/L)Tris-HCL緩沖液(pH7.4)再加入 10-100μL水蛭素溶液,充分混均。用微量注射器吸取標準的凝血酶溶液(20NIH單位 )5μL(即 0.1NIH單位),若在1min內纖維蛋白原發生凝固,即說明已經達到滴定終點。若沒有發生凝固,則換取40NIH/mL單位的凝血酶溶液進行滴定,若仍沒有凝固,則逐步擴大范圍直至確定活性范圍。

3 結果

表1 氯化鈉溶液誘導結果

表2 氯化鈉+L-精氨酸誘導結果(U=40)

4 結論

通過應用仿生誘導的方法對活體水蛭進行誘導后比較發現,當誘導溶媒為不同濃度氯化鈉溶液時,其最佳的提取濃度為0.9%,也就是生理鹽水組的提取效果較好。當誘導溶媒為氯化鈉+L-精氨酸時,發現150mL NaCl加 4mL-精氨酸組的效果最好,能夠得到最大劑量的水蛭素。綜合兩種誘導溶媒發現,誘導溶媒為氯化鈉+L-精氨酸的效果較好。

本實驗對水蛭素含量測定采用改進后的凝血酶滴定法,即逐步縮小活性范圍,多次換管重滴的濃度梯度法,對水蛭分泌的唾液進行含量測定時,具有節省時間,重復性和準確度都較好的優點。