氯沙坦對心力衰竭大鼠心肌細胞 Bax、Bcl-2蛋白表達的影響△

四川瀘州醫學院附屬醫院兒科(瀘州 646000) 陳書琴 杜 娟 朱紅楓

近年來的研究證實,心力衰竭(Heart failure,HF)是心血管疾病的終末階段的臨床表現,心肌細胞凋亡是 HF發生發展的一個重要的病理生理基礎,通過阻斷、干預凋亡去治療 HF的認知得到迅速發展。王志堅等[1]研究發現心力衰竭患者血漿 ET-I、AngⅡ濃度明顯升高,氯沙坦具有降低 ET-1的作用。本實驗通過建立心力衰竭模型,采用 TdT介導的 dUTP缺口末端標記技術(TUNEL)判定心肌細胞凋亡,并采用免疫組化方法研究心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡調節蛋白 Bax、Bcl-2的表達,探討氯沙坦對心力衰竭時心肌細胞凋亡的影響及其在積極逆轉心肌受損,改善心衰進程中的作用。

材料與方法

1 動物與試劑 8周齡健康、雄性 SD大鼠 24只由瀘州醫學院動物實驗中心提供;鹽酸阿霉素(Adriamycin,ADR)由浙江海正藥業股份有限公司生產,氯沙坦由杭州默沙東制藥有限公司生產;TUNEL試劑盒(原位細胞凋亡檢測試劑盒)為德國 Roche公司生產;Bax試劑盒,Bcl-2試劑盒,DAB顯色劑為北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制作 將 24只大鼠隨機分為 3組:對照組、心衰組、氯沙坦干預組各 8只。參照《現代醫學實驗動物學》將鹽酸阿霉素粉針用滅菌注射用水溶解,心衰組:腹腔注射 ADR(4 mg/kg,每周 1次,共 6周,累積總量 24 mg/kg;氯沙坦干預組腹腔注射 ADR 4 mg/kg,同時每天給氯沙坦 20 mg/kg灌胃,對照組:注射相同體積的注射用水。

2.2 心肌石蠟切塊的制備 末次給藥 24 h,取出心臟洗凈固定 12 h,二甲苯透明,石蠟包埋,切片用以檢測心肌細胞凋亡及 Bax與 Bcl-2基因的蛋白表達檢測。

2.3 心肌細胞凋亡指數檢測 用 TUNEL法,按試劑盒說明操作,以細胞核被染成棕褐色為陽性結果。每個標本觀察凋亡陽性細胞,計算平均陽性細胞百分數。按公式:凋亡指數(AI):凋亡細胞核數 /總細胞核數計算。

2.4 Bax、Bcl-2蛋白表達的檢測 石蠟切片脫蠟水化,PBS漂洗,滴加正常羊血清室溫下封閉,棄去羊血清,滴加一抗;PBS漂洗,滴加生物素化二抗(1∶100);PBS漂洗,鏈霉素-生物素化 HRP復合物(1∶100);PBS漂洗,Tris-HCl緩沖液漂洗,DAB顯色后漂洗;蘇木素淡染,脫水,透明,中性樹膠封片,鏡檢。陰性對照以 PBS代替一抗孵育,其他步驟相同;陽性對照用已知的陽性標本。

2.5 計算機圖像分析 用計算機圖像分析系統(IPP6.0)進行定量分析,測定陽性染色的平均光密度(MOD)與陽性細胞百分比(指陽性細胞占視野中所有細胞數的百分比),分析心肌組織中 Bcl-2,Bax蛋白陽性染色面積百分數。蛋白陽性表達指數(PEI):PEI(%)= MOD×陽性細胞百分比×100%。

3 統計學處理 各組之間指標的比較用SPSS13.0軟件包進行秩和檢驗,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 各組心肌細胞凋亡指數檢測結果 見表 1。對照組心肌細胞凋亡指數均比其他各組低,而心衰組心肌細胞凋亡指數較氯沙坦干預組高,提示氯沙坦有抑制心肌細胞凋亡的作用。

表1 各組心肌細胞凋亡指數的比較(±s)

表1 各組心肌細胞凋亡指數的比較(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.01;與心衰組比較,△P＜0.01

組 別 n 心肌細胞凋亡指數對照組 8 0.92±1.64心衰組 8 22.28±5.32*氯沙坦干預組 8 13.49±7.45△H值 19.86 P值 0.000

2 Bax和 Bc1-2基因蛋白表達結果 見表 2。心衰組和氯沙坦干預組心肌細胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表達顯著高于對照組(P＜0.01),與心衰組相比,氯沙坦干預組明顯下調 Bax基因表達,上調 Bc1-2基因表達(P ＜0.01)。

表2 各組心肌細胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表達的PEI比較 (± s)

表2 各組心肌細胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表達的PEI比較 (± s)

注:*與對照組比較,P＜0.01;△與心衰組比較,P＜0.01

組 別 n Bax Bc1-2對照組 8 0.53± 0.07 0.69± 0.11心衰組 8 17.92± 9.81* 5.39± 0.64*氯沙坦干預組 8 8.32± 11.06△ 10.49± 7.59△H值 18.24 18.17 P值 0.000 0.000

討 論

實驗研究[2]發現:ADR具有嚴重的心臟毒性作用,采用連續腹腔注射 ADR,可使心肌細胞變性壞死,降低心功能并出現 CHF。本實驗研究表明,心衰組心肌細胞凋亡指數較對照組升高,證明了 HF時心肌細胞存在凋亡。而氯沙坦干預組心肌細胞凋亡指數比心衰組降低,這表明氯沙坦具有降低心肌細胞凋亡,保護HF的作用。與陳源源等[3]報道結論一致。

細胞凋亡受多種基因調控,這一過程受多種促凋亡和抗凋亡的蛋白調節,其中促凋亡基因 Bax和凋亡抑制基因 Bc1-2被認為與細胞凋亡關系密切[4],張光謀等[5]報道 Bcl-2和 Bax基因參與了心肌肥大心肌細胞凋亡的調控。Bc1-2它可抑制多種因素如氧自由基和 p53誘導的細胞凋亡[6]。Bax為促凋亡因子,其過度表達將加速由白細胞介素-3介導的細胞凋亡。當觸發因素存在時,Bcl-2/Bax的比值決定著細胞是存活或是死亡。心肌細胞凋亡是心衰從代償走向失代償的轉折點[7]。

實驗研究表明 AngⅡ可誘導心肌細胞凋亡[8],在AngⅡ引起細胞凋亡的過程中有較多的信號通路參與。已經證實 AngⅡ的主要心血管生物效應由 AT1受體介導,通過細胞內的信號傳導途徑刺激 Bax的表達,抑制 Bcl-2表達,細胞內蛋白磷酸化增加,最終激活細胞內核酸內切酶和 Caspase蛋白酶,使細胞發生凋亡。因此,AT1R拮抗劑不僅具有血液動力學效應,還可能通過抑制 AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡而產生心肌保護作用[9]。

氯沙坦為新型血管緊張素Ⅱ受體Ⅰ拮抗劑,在本試驗中氯沙坦干預組通過阻滯 AngⅡ的促凋亡作用,顯著抑制了心肌細胞凋亡。本實驗結果提示:氯沙坦干預組比心衰組的心肌細胞凋亡指數明顯降低,同時對抑凋亡基因和促凋亡基因具有雙向調節的作用,能上調抑凋亡基因 Bcl-2蛋白的表達,下調促凋亡基因 Bax蛋白的表達,從而抑制或阻斷心肌細胞凋亡的發生。說明氯沙坦抑制心肌細胞凋亡能逆轉心肌受損,改善心衰進程,這可能是氯沙坦防治心力衰竭的分子作用機制之一。

綜上所述,氯沙坦能通過拮抗神經內分泌、抑制血管緊張素Ⅱ的產生,調節凋亡基因 Bc1-2、Bax的表達,為氯沙坦治療心力衰竭的機制提供了最直接的證據。在凋亡的早期[10],阻斷線粒體途徑介導的心肌細胞凋亡,可以抑制或逆轉心肌重構、改善心功能、延緩或逆轉心力衰竭的發生發展。

[1] 王志堅,杭 娟.氯沙坦對心力衰竭患者血漿內皮素-1和降鈣素基因相關肽的影響 [J].中華現代內科學雜志,2006,3(5):501-503.

[2] 楊建業,張迎春.阿霉素誘導大鼠心衰模型的建立.鄖陽醫學院學報,2005,24(5):269-271.

[3] 陳源源,孫寧玲.纈沙坦對自發性高血壓大鼠心肌凋亡及Bcl-2、Bax蛋白的表達的影響 [J].高血壓雜志,2004,12(2):151-155.

[4] Chen C,Cui J,Lu H,et al.Modeling of the role ofa Baxactivation switch in the mitochondrial apoptosis decision[J].Biophys,2007,92(12):4304-4315.

[5] 張光謀,許重潔,王興平,等.心肌肥大大鼠心肌細胞凋亡與 Bcl-2、Bax蛋白表達的變化 [J].陜西醫學雜志,2009,38(4):396-411.

[6] Zhou J,Luo RB,Tang CF,et al.Efect of Bcl-2 protein family and p53 gene on regulating and controlling cell apoptosis[J].Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu Linchuang Kangfu,2007,11(10):1950-1952.

[7] 胡大一,馬長生.心臟病學實踐-新進展與臨床案例.北京:人民衛生出版社,2005:61-62.

[8] Schmidt-OttKM,KagiyamaS,Ianphillips M.The multiple actions of angiotensin II in atherosclerosis[J].Peptides,2000,93(1):65-77.

[9] 榆 華,遲路湘.血管緊張素Ⅱ /l型受體拮抗劑對心肌細胞凋亡影響及機制[J].中國分子心臟病學雜志,2008,8(2):83-86.

[10] Khoynezhad A.Promising aspects and caveats of studies on anti-apoptotic therapies in patients with heart failure[J].Eur J Heart Fail,2007,9(2):120-123.