高滲氯化鈉羥乙基淀粉 40注射液對內毒素性急性肺損傷大鼠腫瘤壞死因子-α表達的影響

寧夏醫科大學附屬醫院麻醉科(銀川 750004) 馬 濤 高玉華 孟盡海 張冬梅

急性肺損傷 (Acute lung injury,ALI)是臨床常見的危重病癥,發病機制錯綜復雜,病死率高達 50%～ 70%[1～3],而全身炎癥反應 (Systemic inflammatory response,SIR)是導致 ALI的根本原因[4,5]。機體受到嚴重創傷、感染、休克和其他致病因素間接或直接刺激后,引起 SIR,此過程涉及眾多細胞因子和炎性介質,形成復雜的炎性反應網絡。大量研究證實,以多形核中性粒細胞(Polymorpho-nuclear neutrophils,PMN)為主的炎性細胞與多種細胞因子在 ALI的發病過程中起著重要作用,如何調控炎性細胞因子的過度釋放,使細胞因子網絡恢復平衡狀態已成為研究熱點。

高滲氯化鈉羥乙基淀粉 40注射液作為新型的羥乙基淀粉,因其取代級低、C2/C6比率高且含有 4.2%的氯化鈉及 7.6% 的羥乙基淀粉,已較廣泛應用于創傷或失血性休克復蘇中。由于 HSH40在休克治療中表現出的特性與 ALI/ARDS相符,故本研究通過復制大鼠內毒素性急性肺損傷模型,將 HSH40用于 ALI的早期液體治療,觀察血氣、肺濕 /干重(W/D)比值和肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性,各時相血清中 TNF-α表達的變化及肺組織的病理改變,探討 HSH40對內毒素性急性肺損傷保護作用及可能機制。

材料與方法

1 實驗動物 健康成年雄性 SD大鼠 54只,體重 250～ 300g,由寧夏醫科大學動物實驗中心提供。實驗前分籠飼養 1周,自由攝取食水。實驗前禁食 12h,禁水 2h。

2 藥物與試劑 LPS(E coli O55∶B5)采購于美國 Sigma公司,HSH40由上海長征富民金山制藥有限公司提供(批號:H20041554),MPO測試盒購自南京建成生物工程研究所,TNF-αELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

3 動物模型與分組 將 54只大鼠隨機分為 3組,每組 18只:空白對照組(C組 )、急性肺損傷組 (L組)和 HSH40組 (H組),每組根據時間點分為 3個亞組(亞組 n=6),即 LPS致傷后 0.5h、2h和 4h。各組動物用 3%的戊巴比妥鈉 30mg/kg腹腔注射麻醉,L組、H組經股靜脈注入 LPS 5 mg/kg致傷,復制急性肺損傷模型[6],C組經股靜脈注入等體積的 0.9%NS。致傷1min后 L組從股靜脈持續輸注 0.9%生理鹽水(0.9%NS)5 ml/kg,H組持續輸注 HSH405ml/kg;C組用等量 0.9%NS作空白對照,10min輸完[7]。

4 觀察指標

4.1 血氣分析 于致傷后 4h經股動脈采集動脈血 0.5ml,即刻在 i? STAT便攜式手持血液分析儀上測定 pH、PO2、PCO2值,記錄血氣分析結果。

4.2 肺 W/D測定 取出右肺下葉,濾紙吸干表面水分,置于干燥稱量紙上稱得濕重(W);置 65℃恒溫箱,烘烤 48h至恒重后稱量干重(D),并計算 W/D。

4.3 測定肺組織 M PO活性 右肺剩余組織在冷生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,精確稱重后,按重量體積比 1∶19加入 0.86%的冷生理鹽水冰浴中制備 5%組織勻漿(勻漿時間 10s/次,間隙 30s,連續 3次)。按照試劑盒說明書步驟,在 460nm處通過比色法測定 MPO活性(單位:活力單位,U/g組織濕片)。

4.4 血清中 TNF-α的測定 分別在大鼠致傷后0.5h、2h和 4h時間點,經右側股動脈采血 2ml,室溫下靜置 20min,離心 (4℃,3000r/min,10min)取上清,裝入無菌 EP管后,置-80℃低溫冰箱中保存。標本收集完整后,采用 ELISA法按照試劑盒說明書步驟,應用全自動酶標定量測定儀進行檢測,根據樣品的吸光度(OD值)可在繪制出的標準曲線上查出其濃度。

4.5 肺組織病理形態學觀察及 ALI病理評分4h組動物處死后,取右肺組織(1cm×1cm×0.5cm)放入 10%中性甲醛溶液固定 48h,常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片 (5 μ m)、脫蠟、脫水、蘇木素伊紅(Hematoxylineosin,HE)染色、脫水、封片后光鏡下觀察肺組織病理形態變化。按照 Mikawa等[8]的方法從四項指標進行肺損傷評分:①肺泡充血;②出血;③間隙或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集;④肺泡間隔增厚或透明膜形成,根據每項指標病變輕重進行 0～ 4分半定量分析(0:無或極輕微損傷;1:輕度損傷;2:中度損傷;3:重度損傷;4:極重度損傷),累加各項評分的總分作為 ALI的病理評分。用 Olympus BX-51顯微鏡對病理切片攝片。

5 統計學處理 應用 SPSS11.5統計軟件進行分析處理。正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示,組內各時間點比較采用單因素方差分析,同一時間點組間比較采用配對t檢驗,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 動脈血氣分析 見表 1。LPS致傷后,大鼠出現低氧血癥,呼吸性堿中毒。H組較 C組無顯著性差異(P＞ 0.05),H組和 C組 pH、PO2明顯高于 L組(P＜0.01),而 PCO2明顯低于 L組 (P＜0.01)。 H組的PO2、PCO2及 pH值較 L組有明顯改善(P＜0.01)。

2 肺 W/D、M PO活性及肺損傷病理評分 見表2。 L組肺 W/D、M PO活性及肺損傷病理評分顯著高于 C組(P＜0.01),H組上述各項指標均明顯下降,與L組相比有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各組大鼠動脈血氣的變化 (±s)

表1 各組大鼠動脈血氣的變化 (±s)

注:*與 C組比較,P＜0.01;#與 L組比較,P＜0.01

組 別 n pH PO2(mmHg) PCO2(mmHg)C 組 18 7.39± 0.02 91.6± 2.41 34.68± 2.42 L 組 18 7.28± 0.02* 56.3± 4.73* 45.66± 1.02*H組 18 7.38± 0.03# 88.7± 2.26# 34.84± 2.66#

表2 肺 MPO、W/D及病理評分結果 (±s)

表2 肺 MPO、W/D及病理評分結果 (±s)

注:*與 C組比較,P＜0.01;#與 L組比較,P＜0.01

組 別 n 肺 W/D M PO活性(U/g組織)肺損傷評分C組 18 4.27± 0.11 3.29± 0.15 0.40± 0.51 L組 18 5.56± 0.28* 7.11± 0.16* 9.50± 1.71*H組 18 4.80± 0.19*# 5.44± 0.12*# 3.80± 0.78*#

3 血清 TNF-α的變化 見表 3。 C組 TNF-α的含量在 3個時間點均無顯著性差異(P＞0.05);L組 3個時間點兩兩間均有顯著性差異(P＜0.01),0.5h表達開始升高,2h達峰值,以后逐漸下降;而 H組 TNF-α的含量與 L組相比明顯降低,但仍高于 C組(P＜0.01),H組內 0.5h～ 2h和 2h～4h有顯著性差異(P＜0.01),0.5h～ 4h無顯著性差異 (P＞ 0.05)。

表3 各亞組大鼠血清中 TNF-α含量的變化(±s,pg/ml)

表3 各亞組大鼠血清中 TNF-α含量的變化(±s,pg/ml)

注:組內比較:*與 0.5h比較,P＜0.01;#與 2h比較,P＜0.01;組間同一時間點比較:▲與 C組比較,P＜0.01;★與 H組比較,P＜0.01

C組 6 49.23± 2.69 49.26± 2.55 47.61± 2.12 L組 6 201.90± 9.05▲ 346.02± 13.25★*180.83± 11.32▲*#H組 6 158.69± 7.91▲★259.85± 17.99▲★*158.54± 5.28▲★#

4 肺組織病理形態學變化 見圖 1～ 3。光鏡下,C組肺組織結構完整,肺泡結構清晰,肺泡腔完整,壁光滑,肺泡間隔均勻一致,可見少量白細胞,肺泡腔中無滲出液或滲出的白細胞;L組肺泡隔明顯增寬,肺泡壁完整結構破壞,肺泡壁斷裂,部分肺泡內見出血及微血栓形成,大量白細胞滲出、聚集,肺泡腔中可見滲出液、紅細胞、多形核中性粒細胞、巨噬細胞,部分肺泡腔萎陷不張 ;H組肺泡壁有輕度水腫,肺間隔略有增厚,但出血和炎性細胞浸潤情況較 L組明顯減輕,肺組織結構基本完整。

圖1 C組肺組織形態學改變(HE×100)

圖2 L組肺組織形態學改變(HE×100)

圖3 H組肺組織形態學改變(HE×100)

討 論

革蘭陰性桿菌是臨床上引起感染的常見微生物,其主要致病物質是內毒素(ET),而 LPS是 ET的主要成分,參與構成革蘭陰性菌的細胞壁,是強誘導劑。LPS趨化、激活中性粒細胞(PMN)在肺間質和肺泡腔內大量聚集、釋放炎性細胞因子、氧自由基等,損傷肺泡-毛細血管膜,使之通透性升高,形成了肺損傷的基本病理改變,與 ALI的發生密切相關[9,10]。本實驗模型組(L組)在注射 LPS 4h后,PO2、pH明顯下降,PCO2升高,肺 W/D顯著增加,肺臟出現了 ALI的病理學改變,肺損傷評分(9.50±1.71分 )明顯升高,說明模型復制成功。

TNF-a是創傷或感染后機體最早產生的多功能細胞因子之一,主要由單核細胞和巨噬細胞產生。Ayata等[11]的研究表明 TNF-a可能是炎性介質鏈鎖反應中最早的啟動因子,對肺有強烈毒性可以通過多種機制引起肺損傷。它可以促使 PMN趨化、聚集、黏附于血管內皮細胞并脫顆粒釋放溶酶體,產生氧自由基等,還能促使單核細胞和巨噬細胞的分化,并使巨噬細胞和內皮細胞釋放 IL-1、IL-6等其他細胞因子而形成級聯反應。

本實驗結果顯示大鼠血清中 TNF-a于注射 LPS后 0.5h開始升高,2h達峰值,以后逐漸降低,經過HSH40治療后,TNF-a含量明顯下降,以 2h最為顯著。表明在 ALI早期,TNF-a的合成和分泌亢進,這種變化導致致炎 /抗炎失衡,通過下列途徑引起 ALI的發生[12,13]:①增加肺血管通透性,引起肺水腫、低血壓;②上調 PMN、肺血管內皮細胞對補體片段 CR3以及細胞間黏附分子(ICAM-1)、P選擇素等黏附分子的表達,促進 PMN與內皮細胞的黏附及遷移;③延遲 PMN凋亡,增加 PMN的細胞毒性及內皮細胞對 PMN介導的殺傷效應的敏感性。而 HSH40在 ALI早期可以抑制TNF-α的合成與表達,使細胞因子網絡恢復平衡狀態,從而減輕肺損傷的發生,發揮肺臟保護作用。

MPO是存在于 PMN嗜天青顆粒中特有的酶 ,心臟、腎和皮膚等疾病的研究證實,M PO活性是評價PMN在組織中扣押浸潤程度的可靠指標[14]。實驗顯示,MPO活性在 C組無明顯改變,L組在 4h顯著升高,而 H組雖高于 C組,但明顯低于 L組。說明 HSH40可以抑制 PMN的呼吸爆發,減輕氧自由基等活性物質對肺的損傷。

HSH40是高滲晶體 /膠體混合液,具有比生理鹽水或其他等滲輸液高 4～ 5倍的滲透壓濃度(滲透壓為1400mOsm/L)。通過高滲氯化鈉產生的滲透壓梯度使水分從細胞內、組織間隙轉移至血管內,以自體輸液的形式快速主動擴充血容量,直接改善微循環;羥乙基淀粉則可以增加膠體滲透壓,穩定和維持有效循環血容量,從而減輕 ALI時的毛細血管滲漏和肺水腫。目前認為高滲晶 /膠液對肺損傷的影響和可能機制有以下幾個方可面:①抑制炎性細胞間和細胞內的信號傳導;②減少中性粒細胞在肺內的扣押和減輕菌群移位,減少內毒素血癥的發生,消除由此介導的 PMN呼吸爆發;③打破致炎效應和抗炎效應之間的平衡,上調抗炎效應;④減少細胞因子和黏附分子的表達。

綜上所述,在內毒素性 ALI時,炎性因子 TNF-a在肺組織中大量產生和表達,PMN黏附、聚集、扣押,肺微血管通透性增高,產生過度炎癥反應。 HSH40通過阻斷 TNF-a的合成與釋放,降低肺微血管通透性,減少白細胞浸潤和減輕炎癥反應,從而對 ALI產生保護作用。

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