麻雞脾臟總RNA提取方法初探

陳書明，常云花，梁新峰，曹新鵬，范 瑾

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

白細胞介素（Interleukin，IL）簡稱白介素，是由白細胞產生并介導于細胞間相互作用的一類細胞因子。其主要作用是通過T和B淋巴細胞及NK細胞等多種靶細胞來傳遞免疫信息，以激活、調控血細胞的生長發育與分化成熟，并參與機體的免疫應答以及某些疾病的病理過程[1-3]。目前，IL已作為藥物應用于臨床，但用傳統的從組織中分離純化IL，很難實現IL的大量生產。因此，通過RT-PCR技術獲得IL的目的基因，再用基因工程技術規模化生產IL成為科研工作者努力的方向。而獲得IL的目的基因需要先從脾臟組織提取出純度高、完整性好的總RNA。目前，已有多種方法與產品應用于總RNA提取和純化，但在實驗過程中，總RNA極易被實驗室環境中存在的RNA酶降解，或提取出來的總RNA中常伴有大分子量染色體DNA的污染[4-7]。

本研究通過控制RNAiso Plus試劑和脾臟組織用量比例，對組織和實驗室環境進行特殊處理，反復研究，最終從麻雞脾臟組織中提取出純度高、完整性好的總RNA。該研究對分子克隆獲得相關目的基因等后續實驗具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 自山西省太谷縣某雞場購進80日齡健康麻雞1只。

1.1.2 試驗試劑 Agarose（瓊脂糖）為Amresco原裝進口；RNAiso Plus購自大連寶生物工程有限公司；Tris和DEPC均購自上海生物工程技術服務有限公司；EDTA、硼酸、95%乙醇、異丙醇、氯仿、溴化乙錠均為國產分析純。75%乙醇、溴化乙錠等用RNase-free ddH2O配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備 在潔凈環境下將麻雞殺死，迅速取出其脾臟，用刀片切成約140，120，80mg的小塊組織，用滅菌紗布包裹后懸吊于液氮罐中保存備用。提取RNA時，從液氮罐中取約140，120，80mg小塊組織各1塊，迅速轉移至3個液氮預冷的研缽中研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒，否則會影響RNA的收率和質量）；再向3個研缽中各加1mL RNAiso Plus，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫下靜置，待其溶化；然后將各組勻漿液轉移至已標記的EP管中，室溫靜置5min。

1.2.2 制備RNA沉淀 將EP管中的勻漿液在4℃，12 000 r/min條件下離心5min；小心吸取上清液，分別移入已滅菌標記的EP管中（切勿吸取沉淀）；再向EP管中分別加入0.2mL氯仿，蓋緊管蓋，用旋渦振蕩儀混勻至溶液呈乳白狀（無分層現象），室溫靜置 5min；4℃，12 000 r/min離心15min。此時，EP管中液體分為3層，即含有RNA的無色上清液，中間的白色蛋白層和帶有紅色的下層有機相。小心吸取上清液并分別轉移至新標記的3個已滅菌的EP管中（切勿吸取白色中間層），再分別加入等體積的異丙醇，上下顛倒EP管充分混勻，室溫下靜置10min；然后于4℃，12 000 r/min離心10min，可見EP管底部出現乳膠狀沉淀，小心棄去上清液，保留沉淀，即為RNA沉淀。

1.2.3 RNA沉淀的洗滌 沿保留RNA沉淀的EP管的管壁緩緩加入75%的乙醇1mL，輕輕上下顛倒EP管5次，在4℃下，12 000 r/min離心5min；然后小心棄凈EP管中的乙醇溶液，再將EP管插入超凈工作臺面的樣品孔中，通風干燥5min，使乙醇揮發干凈（不可以加熱干燥，否則RNA將很難溶解），再用RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，從而獲得RNA溶液。

1.2.4 RNA純度與完整性的檢測 取3μL RNA溶液與等量的上樣緩沖液混勻，點樣，進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測所提取RNA的純度與完整性。用紫外分光光度計測定剩余RNA溶液的A260與A280，并計算二者的比值A260/A280，進一步分析所提取RNA的純度。

2 結果與分析

對脾臟組織用量約為80 mg時提取的總RNA進行紫外分光光度檢測得出，A260=0.896，A280=0.452，A260/A280=1.982。

從圖1可以看出，當組織用量約140mg時，RNA幾乎全部降解（圖1-A）；當組織用量約120mg時，RNA降解嚴重（圖1-B）；當組織用量控制在約80mg左右時，提取到的RNA電泳圖譜中可見清晰的3條帶（圖1-C），分別為5S，18S，28 S，A260/A280=1.982，1.8＜A260/A280＜2.0，說明從雞脾臟組織中提取的RNA純度與完整性良好。表明用1mL的RNAiso Plus試劑，并且把脾臟組織用量控制在80mg左右時，可提取出純度高、完整性好的總RNA。

3 討論

本研究表明，用相同量的提取劑（RNAiso Plus）提取麻雞脾臟組織中的RNA時，并不是組織越多，提取的RNA量就越多；相反，過量的組織中存在過量的RNA酶，所加的RNAiso Plus試劑不能抑制過量RNA酶的活性，使得提取過程中RNA很快被降解。但是，試驗所用脾臟組織也不可太少，否則會因樣品中總RNA含量不足，難以提取出足夠量的純度高、完整性好的總RNA。

本實驗成功與否的關鍵是有無RNA酶的污染。RNA極不穩定，易被RNA酶降解，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩定，故在提取RNA時需最大程度地避免外源RNA酶的污染和抑制內源RNA酶的活力。因此，在本實驗中，除了用液氮迅速處理新鮮的麻雞脾臟組織、控制RNAiso Plus試劑和脾臟組織用量比例，以抑制內源RNA酶的活力外，還用DEPC溶液對本實驗所用物品進行了處理，使用RNA專用儀器設備，操作過程中使用一次性PE手套和口罩等。上述措施對本實驗的成功起了非常重要的作用。

［1］ 陳紅英，崔保安，黃青云，等.海藍雞白細胞介素18全基因的克隆與序列分析 [J].中國預防獸醫學報，2006，28（1）：48-50.

［2］ 胡進東，崔志中，范偉興，等.雞白細胞介素18成熟蛋白全長基因的克隆與序列分析[J].中國獸醫學報，2004，24（2）：119-121.

［3］ 徐永莉，王紅寧，黃勇，等.雞白介素的分子生物學和應用研究進展[J].動物醫學進展，2007，28（6）：57-60.

［4］ 李晶，王亦學，鄭德剛，等.一種簡單高效提取棉花不同組織總 RNA的方法[J].山西農業科學，2009，37（5）:17-19.

［5］ 李杰之，常曉彤，林堅，等.從動物組織中提取高純度總RNA方法的改進及應用 [J].生物技術通訊，2002，13（5）：346-348.

［6］ 王桂林，劉戈飛，黃東陽.從動物組織中提取高質量總RNA方法的改進[J].生物技術通訊，2003，14（6）：512-514.

［7］ 董增軍，李德春，陳紹先.快速法提取人淋巴細胞總RNA[J].中國免疫學雜志，1991，7（1）：56-57.