心復康聯合骨髓間充質干細胞移植對瀕死心肌的保護作用*

李廣斌，蘇金玲，姜希娟，范英昌

（天津中醫藥大學基礎醫學院，天津 300193）

心復康聯合骨髓間充質干細胞移植對瀕死心肌的保護作用*

李廣斌，蘇金玲，姜希娟，范英昌

（天津中醫藥大學基礎醫學院，天津 300193）

[目的]探討中藥心復康聯合骨髓間充質干細胞（BMSCs）移植在大鼠急性心肌梗死后對瀕死心肌的保護作用及其機制。[方法]經密度梯度離心聯合貼壁篩選法培養并純化BMSCs，采用冠狀動脈結扎法建立大鼠急性心肌梗死模型，移植前以5-溴脫氧尿核苷（Brdu）對移植細胞進行標記，術后采用中藥心復康灌胃聯合干細胞移植治療。治療后2周處死動物，免疫組織化學方法檢測心肌損傷區Brdu陽性移植細胞數、CD34+新生血管數和細胞增殖核抗原（PCNA）陽性心肌細胞數量。[結果]心復康聯合干細胞移植治療組移植細胞存活率增加（與細胞移植組比較P<0.05），梗死邊緣區新生血管數量及PCNA陽性心肌細胞數量均有所增加（與細胞移植組比較P<0.05）。[結論]中藥心復康聯合干細胞移植對大鼠急性心肌梗死后瀕死心肌細胞有明顯的保護作用，其機制可能與心復康聯合干細胞移植能更有效的促進損傷區血管新生有關。

心復康；骨髓間充質干細胞；心肌梗死；血管新生

最近，中藥聯合骨髓干細胞移植治療心肌梗死取得了令人鼓舞的進展，顯示出中藥在干細胞移植過程中存在的特有優勢：毒副作用小，促進干細胞增殖、分化等[1-2]。本實驗采用中藥心復康干預骨髓間充質干細胞移植治療實驗性大鼠心肌梗死，以觀察中藥心復康聯合干細胞移植對大鼠心肌梗死后梗死周邊區域心肌的保護作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雄性，體質量150～250 g（軍事醫學科學院第四研究所動物實驗中心）,LDMEM培養基（美國GIBCO公司），胎牛血清（FCS，美國Hyclone公司），胰蛋白酶（Difco），乙二胺四乙酸（EDTA，天津聯星試劑公司），5-溴脫氧尿核苷BrdU（Sigma公司），CD34、細胞增殖核抗原（PCNA）免疫組化試劑盒（天津聯星試劑公司），BrdU石蠟切片免疫組化試劑盒（天津市灝陽生物制品有限公司），中藥心復康（天津中醫藥大學第一附屬醫院制劑室）。

1.2方法

1.2.1 BMSCs體外分離培養和BrdU標記 本實驗采用密度梯度離心和貼壁篩選法培養并純化骨髓間充質干細胞（BMSCs），該方法可獲得較純的BMSCs，Pittenger等用流式細胞儀檢測培養的第1代、第2代BMSCs的均質性分別達到95%和98%[3]。

5-溴脫氧尿核苷（BrdU）標記：每日觀察原代及傳代的細胞生長狀況，需加BrdU的培養瓶中預先加入0.5 cm×1.0 cm無菌玻片，當細胞鋪滿瓶底50%時加入BrdU溶液10μmol/L（BrdU 50mg；二甲基亞砜 0.8mL；水 1.2m L）分別孵育 24、48、72、96 h。取出玻片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，4%多聚甲醛固定15min，進行Brdu免疫組化染色（嚴格按試劑盒說明進行）。

1.2.2 動物模型制備 同基因型雄性Wistar大鼠，190～210 g，乙醚吸入麻醉。頸部正中切口，插入氣管套管，行呼氣末正壓通氣，標準肢體Ⅱ導聯記錄心電圖。在胸部左側約0.5 cm處第4、5肋間切開皮膚，鈍性剝離肌肉層，剪開心包，暴露心臟，以左冠狀動脈主干為標志，在左心耳根部下方2mm處用無創小圓針結扎左冠狀動脈前降支。手術15min，心電圖S-T段呈單向曲線，術后兩周蘇木精-伊紅（HE）染色見明確梗死區示手術成功。

1.2.3 BMSCs移植 移植前48 h在培養液中加入終濃度為10μmol/L的Brdu對移植細胞進行標記。胰酶消化，PBS 反復沖洗、離心（1 500 r/min，5min）2次，加入PBS液調整細胞濃度為2×106個/L。治療組手術結扎冠狀動脈15min后，再次打開胸腔，暴露心臟，用結核菌素注射器吸取1mL細胞懸液，分別于結扎區和附近心肌組織分5點注射細胞，對照組和模型組注射相同劑量生理鹽水，注射完畢后，關閉胸腔，并注射2 d青霉素。

1.2.4 動物分組 實驗分為4組：假手術組（S組，n=10）：只開胸穿線，不結扎左冠狀動脈前降支。模型組（AMI組，n=10）：開胸結扎左冠狀動脈前降支。單純細胞移植組（B 組，n=10）：手術后 15min，注射培養的BMSCs。中藥聯合細胞移植組（X+B組，n=10）：手術后15min移植培養的BMSCs，并按體表面積法計算中藥劑量的10倍[81 g/（kg·d）]灌胃2周。

1.2.5 中藥制備 將中藥心復康（由西洋參、白術、枸杞子、女貞子、土鱉蟲等組成）置于砂鍋中，加入相當于藥材體積5倍的自來水浸泡1～2h，煮沸30min，濾過藥液，再加入3倍量的自來水繼續煮沸20min，過濾，合并兩次濾液，將藥物濃縮至200mL備用。

1.3 指標檢測 進行移植細胞存活率、新生微血管密度及PCNA陽性心肌細胞數檢測。處死動物，以結扎線為標志，每隔3mm取大鼠心臟橫斷面，每只大鼠心臟取材3塊組織，制成切片，免疫組織化學方法檢測心梗區Brdu陽性移植細胞數、CD34+新生血管數和PCNA陽性心肌細胞數（操作按試劑盒說明進行）。Nikon光學顯微鏡400倍視野下,每個組織切片隨機選取10個視野,取10個視野平均值。移植細胞計數Brdu（＋）細胞，CD34陽性的血管計數時，相互分離的內皮細胞、內皮細胞簇、內皮細胞條索均按1個微血管計數，管腔大于8個紅細胞大小，且帶有較厚肌層的血管則不予計數；計算PCNA陽性率時,光鏡下沒有細胞質的增殖核,不計算在PCNA陽性率之中[4]。

1.4 統計學方法 所有實驗數據采用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數比較用單因素方差分析，均數比較采用t檢驗。

2 實驗結果

2.1 BMSCs分離和培養 分離接種的細胞鏡下呈圓形，大小不一，數目較多，48 h后貼壁，8～9 d后大部分細胞變成長梭形，少部分呈多角形。此期的細胞生長迅速，互相連接。傳代培養2～3代后，細胞形態變得較為一致，呈紡錘形、梭形、多角形，增殖迅速，集落之間相互靠近，融合后呈漩渦狀。至培養的第12天左右細胞達到80%～90%融合，此時已傳至第3代，細胞形態成較一致的長梭形。將此時細胞收集用于細胞移植實驗。

2.2 BMSCs標記 骨髓間充質細胞培養至40%～50%貼壁時加BrdU，在培養過程中，BMSCs呈紡錘形,可以貼壁生長、增殖。第8天,培養瓶中幾乎所有的細胞都呈紡錘形的間充質干細胞。各標記組均見BrdU陽性細胞，Brd U陽性反應物位于細胞核，呈棕色、顆粒狀或彌漫性分布。各組觀察200個細胞，記錄Brd U陽性細胞的數目。結果可見標記24、48、72 h各組之間細胞陽性數明顯增加，筆者選用標記72 h作為最佳標記時間進行后續實驗，標記率＞96%，能夠滿足實驗需要。

2.3 各組大鼠梗死區域BrdU陽性移植細胞檢查結果 與細胞移植組比較，心復康聯合細胞移植組BrdU陽性細胞數有所增加（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠Brdu陽性細胞數的比較(±s)Tab.1 Com parison of cellamountof Brdu+in ratsof each group(±s)

表1 各組大鼠Brdu陽性細胞數的比較(±s)Tab.1 Com parison of cellamountof Brdu+in ratsof each group(±s)

注：與細胞移植組比較★P<0.05。

組別B組X+B組n 10 10個/高倍視野7.40±1.52 8.76±2.38★

2.4 各組大鼠梗死周邊區域新生血管及PCNA陽性心肌細胞檢查結果 與假手術組比較，各組PCNA陽性心肌細胞數量和新生血管數量均升高（P<0.01）；與模型組比較，單純移植組PCNA陽性心肌細胞數量無統計學差異，心復康聯合干細胞移植組PCNA陽性心肌細胞和新生血管數量升高，（P<0.05）；與移植組比較，心復康聯合干細胞移植組PCNA陽性心肌細胞數及新生血管數量升高（P<0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠PCNA陽性心肌細胞數量和新生血管數量的比較(±s)Tab.2 Com parison of cardiacmuscle amountof PCNA+and neonatalvesselsof cd34+in ratsof each group(±s)

表2 各組大鼠PCNA陽性心肌細胞數量和新生血管數量的比較(±s)Tab.2 Com parison of cardiacmuscle amountof PCNA+and neonatalvesselsof cd34+in ratsof each group(±s)

注：與假手術組比較※P<0.05，※※P<0.01 與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與細胞移植組比較★P<0.05。

?

3 討論

筆者的實驗采用PCNA標記細胞的增殖，PCNA是酸性核蛋白，作為增殖細胞核抗原是真核細胞DNA合成所必須的一種核蛋白，PCNA在正常成年動物的心肌組織中沒有表達，而在未成熟心肌和晚期衰竭心肌中有陽性表達[4]。

筆者的實驗評價了不同處理方法后各實驗組細胞增殖情況的差別，從結果來看聯合治療組PCNA陽性細胞數較模型組有所升高，并且大多數細胞形態接近于血管內皮細胞或成纖維細胞，其中,在梗死區及其邊緣,大量的間質細胞PCNA陽性表達反映了血管新生和瘢痕形成。

從實驗結果看，各治療組均有PCNA陽性的心肌細胞出現，單純細胞移植組PCNA陽性細胞數與模型組比較沒有明顯增多，而中藥聯合細胞移植組PCNA陽性心肌細胞數要多于單純細胞移植組，說明中藥在促進心肌細胞PCNA陽性表達方面占有優勢。

筆者認為中藥促進心肌細胞的修復和增殖中可能基于以下機制：一方面，心復康中的主要成分能夠促進梗死周邊區域血管新生，從而改善該區域血供，實驗證實，聯合治療組新生血管數要高于單純細胞移植組和模型組（P<0.05）。另一方面，心復康中主要成分如西洋參具有改善心功能，增加免疫，抗應激的作用，所含的皂苷有抗心律失常，抗心肌缺血，抗心肌氧化的作用；川芎所含的川芎嗪有保護心肌缺血損傷，降低心肌耗氧量的作用；丹參活血化瘀，所含的丹參酮ⅡA，有改善心肌缺血，對心肌梗死有保護作用，并能改善微循環。

心肌梗死屬于中醫“胸痹”“厥心痛”的范疇。《金匱要略》認為胸痹心痛的病機為“陽微陰弦”本虛標實。中藥復方心復康以益氣養陰，活血化瘀為根本大法，方中西洋參甘寒之品，補氣養陰、清火生津；鹿銜草甘溫補陽，微補腎陽、健脾理氣；女貞子辛苦清涼，補中有清，滋而不膩，為補益肝腎之良藥；丹參擅長活血化瘀，為活血化瘀的常用藥；川芎味薄而氣清，為陰中之陽，故能行血中之氣；土鱉蟲具破血逐瘀之力，其力猛而性溫和。全方扶正祛邪，調和氣血運行，從而使正勝邪去，氣血盈暢，達到病去人安。筆者的實驗證實心復康對移植BMSCs存在一定保護作用，其機制可能與促進心肌損傷區血管新生有關，這一結果為中藥聯合BMSCs移植治療心肌梗死提供了一定的實驗依據。

[1]盧新政,張曉友.人參皂苷Rg1對培養豬骨髓基質細胞增殖的影響[J].中國藥理學通報,2003,19(3):353-354.

[2]祝曉玲,祝彼得.黃芪體外作用對貧血小鼠骨髓基質細胞分泌SCF的影響[J].細胞與分子免疫學雜志,2002,18(4):396-397.

[3]Pittenger C.,PittengerM.F.,Cahill K.S.,etal.Human Mesenchymal Stem Cells Differentiate to a Cardiomyocyte Phenotype in the Adult Murine[J].HeartCirculation,2002，105(1):93-98.

[4]李 灝,何建國.心力衰竭大鼠心肌細胞增殖與心功能的關系研究[J].中華醫學雜志，2006，86（2）：102-105.

Protective action on im pending death cardiacmusclesby the therapy of traditionalChinesemedicine XinFuKang combined with transp lanted bonemesenchymalstem cells

LIGuang-bin， SU Jin-ling，JIANGXi-juan
（Tianjin University of TraditionalChineseMidicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To discuss the protective action on impending death cardiacmusclesby the therapy of traditionalChinesemedicine XinFuKang(XFK)combined with transplanted Bonemesenchymal stem cells（BMSCs） after rats acutemyocardial infarction.[Methods]BMSCswere cultured and purified by gradientcentrifugation-adhesivemethod.The ratswith acutemyocardial infarction were builted by coronary artery ligation.Before transplation,BMSCs were signed by Brdu,and after the OPS.of coronary artery ligation,the therapy methodewas XFK combining BMSCs transplantation.After2weeks,wemeasured cellamountof Brdu,neonatalvesselsofCD34 and the cardiacmuscle of PCNA around the infarctarea bymethod of IHC.[Results]Themethod of XFK combining BMSCs transplantation can increase livability of transplanted BMSCs,enhance the amount of neonatal vessel and PCNA cardiacmuscle around infarctarea(compared with group of BMSCs tranplation,P<0.05).[Conclusion]The therapy of XFK combined with BMSCs transplantation have better protection on the impending death cardiacmusclesaround the infarctarea,themechanism maybe the therapy can promote the vessels regeneration.

XinFuKang；BMSCs；Myocardial infarction；Vessel regeneration

R285.5

A

1672-1519(2010)01-0147-03

天津市衛生局中西醫結合科研基金項目（03035）。

李廣斌（1975-），男，碩士，講師，主要從事心血管疾病研究及教學工作。

范英昌。

2009－08－20）