輻射損傷所致血虛證小鼠模型及四物湯反證的代謝組學研究*

霍 超 ，王 穆 ，馬增春 ，張 琪 ，顏賢忠 ，張伯禮 ，高 月

（1.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理與毒理研究室，北京 100850；

2.軍事醫學科學院生物醫學分析中心，北京 100850；3.天津中醫藥大學，天津 300193）

輻射損傷所致血虛證小鼠模型及四物湯反證的代謝組學研究*

霍 超1，王 穆1，馬增春1，張 琪2，顏賢忠2，張伯禮3，高 月1

（1.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理與毒理研究室，北京 100850；

2.軍事醫學科學院生物醫學分析中心，北京 100850；3.天津中醫藥大學，天津 300193）

[目的]通過檢測輻射損傷所致血虛證及用四物湯干預治療后小鼠內源性代謝物的變化，確定輻射損傷所致血虛證小鼠的血清及組織相關的生物標記物，基于代謝組學的方法考察血虛證證本質及四物湯的作用機制。[方法]C57小鼠按體質量隨機分為正常組、輻射造模組、四物湯反證組。造模7 d后于小鼠股動脈取血，同時取脾臟、胸腺及股骨骨髓，并分別提取血清及組織的脂溶性和水溶性代謝物。[結果]主成分分析結果顯示正常組、血虛證模型組以及四物湯反證組能夠明顯的區分。[結論]四物湯治療血虛證的機制可能與穩定細胞膜，維持細胞內外滲透壓平衡；調節糖酵解，促進機體正常能量代謝以及增強機體抗氧化能力、免疫力有關。

輻射；四物湯；血虛證；代謝組學；核磁共振

血虛證是臨床常見證候，表現為血液虧虛、臟腑百脈失調、全身虛弱等。有關血虛證的動物模型造模方法的研究已經開展了大量的工作，其中γ射線造模是發展比較成熟的方法之一，輻射主要造成白細胞下降，骨髓造血功能障礙[1]。四物湯是治療中醫血虛證的首選藥，課題組已經在外周血象、骨髓造血干/祖細胞的數量和質量、CD34+細胞表達，細胞周期、細胞凋亡和造血及免疫相關基因、蛋白的表達等方面考證了其藥理作用[2-5]。實驗利用基于核磁共振波譜（NMR）技術檢測與造血和免疫相關的體液和組織，如血清、胸腺、脾臟和骨髓的提取物，希望從生化代謝的分子層面找出與輻射所致血虛證及四物湯反證相關的代謝譜變化，從中發現相關生物標記物，對血虛證的病理實質及四物湯的藥理作用做進一步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物來源及制備 四物湯由熟地黃、當歸、白芍、川芎組成，按《太平惠民和劑局方》規定的劑量比例組成。藥物按本室以前報道方法制備[5]。

1.2 動物分組與處理 實驗用C57小鼠30只，體質量（18±2）g，購自軍事醫學科學院實驗動物研究中心，合格證號為SCXK-（軍）-2002-001。將小鼠按體質量隨機分為正常對照組、模型組和四物湯反證組，小鼠常規飼養數天適應環境后，模型對照組和四物湯組采用60 Coγ射線全身1次照射，照射劑量3.5 Gy。照射后四物湯反證組立即灌以四物湯藥液[10 g/（kg·d）]，連續灌胃7 d[6]。

1.3 樣品制備及處理 于造模后第7天對各組動物進行股動脈取血制備血清，處死動物后取胸腺、脾臟以及股骨上段骨髓。按照參考文獻進行1維氫譜（1H）NMR檢測樣品制備[7]。

1.41H NMR數據采集 血清：分別采用弛豫編輯脈沖序列（CPMG）、擴散編輯脈沖序列（LED）進行試驗，采用預飽和方式抑制水峰，核磁共振自由感應衰減（FID）信號經過傅立葉變換轉為一維NMR譜圖。調用VNMR程序分別將CPMG譜的δ4.4～0.4以及LED譜的δ6.0～0范圍內的譜峰進行分段積分。將積分數據歸一化之后輸出，用于模式識別分析[8]。

組織提取物：采用有預飽和的1D核歐豪斯效應分光光度法（NOESY）脈沖序列，在弛豫延遲期間采用預飽和方式抑制水峰。FID信號經過傅立葉變換轉換為一維NMR圖譜。以2，2，3，3－三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）為化學位移參考峰的位置，將δ6.0～0.4（水溶性成分）以及 δ8～0（脂溶性成分）內的譜圖進行分段積分，將所產生的所有積分數據歸一化，用于進行模式識別分析[9]。

1.6 主成分分析 將所得到的數據文件輸入SIMCA-P10.0軟件包進行PCA分析，必要時加上正交信號校正處理。

2 實驗結果

2.1 輻射損傷所致血虛證小鼠血清代謝組學變化分別采用CPMG和LED序列檢測血清。結果顯示，正常組、輻射損傷所致血虛證模型組以及四物湯反證組血清代謝物的組成在第一主成分（PC1）上能夠明顯區分（圖1A、C）。從因子載荷圖中（圖1B、D）我們可以進一步發現對這種區分貢獻最大的代謝物分別為：葡萄糖、肌酐、磷酸化膽堿、膽堿、肌酸、乳酸、低密度脂蛋白。其中磷酸化膽堿、肌酸、低密度脂肪酸的含量上升，藥物處理后其含量下降；葡萄糖、膽堿、乳酸的含量下降，給予四物湯處理后其含量上升。

圖1 綜合放血法所致血虛證及四物湯反證小鼠血清代謝物變化的分析結果Fig.1 Analysison serum metabolic product inm icewith blood efficiency induced by synthetic blood-letting and with contrary syndromeof SIWu decoction

2.2 輻射損傷所致血虛證小鼠胸腺提取物的代謝組學變化 對胸腺水溶性和脂溶性提取物的主成分分析發現，正常組、輻射損傷所致血虛證模型組以及四物湯反證組之間能夠明顯的區分。其中，在水溶性提取物的主成分分析結果顯示，輻射損傷所致血虛證模型組與正常組和四物湯反證組兩組在第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）上均能有效的區分。

2.3 輻射損傷所致血虛證小鼠脾臟提取物的代謝組學變化 對脾臟水溶性提取物的主成分分析的結果顯示，輻射損傷所致血虛證模型組和四物湯反證組兩組與正常組之間有明顯不同，而模型組和四物湯反證組之間并不能有效的區分；對脂溶性提取物的主成分分析顯示，正常組與輻射損傷所致血虛證模型組以及四物湯反證組在第一主成分（PC1）上能夠明顯的區分。

2.4 輻射損傷所致血虛證小鼠骨髓提取物的代謝組學變化 對骨髓水溶性提取物的主成分分析發現，正常組與輻射損傷所致血虛證模型組以及四物湯反證組之間在第一主成分（PC1）上和在第二主成分（PC2）上均能夠明顯的區分；對骨髓脂溶性提取物的主成分分析發現，正常組和四物湯反證組兩組與輻射損傷所致血虛證之間有明顯的不同，四物湯反證組與正常組有重疊的趨勢。

4 討論

乳酸是糖酵解過程正常代謝產物，在缺氧的條件下在乳酸脫氫酶的催化下由丙酮酸生成，維持機體正常的能量代謝[10]。乳酸水平的異常提示機體能量代謝失調，機體無氧氧化功能受損；四物湯反證后，能夠明顯逆轉上述效應，因此可以推測四物湯能夠改善機體的能量代謝。膽堿是乙酰膽堿的重要前體，是體內的重要的甲基供體，是能量代謝和脂類代謝的重要參與者[11]。膽堿相對含量的改變就進一步說明了血虛證模型中存在著能量代謝功能的損害，并提示機體可能有脂類代謝的失調，四物湯能夠明顯逆轉血虛證模型中膽堿含量的改變，可能與四物湯能夠改善機體的能量代謝和脂類代謝有關。牛磺酸是體內一種重要的含硫氨基酸，具有穩定細胞膜，協助鈣離子、鎂離子、鈉離子、鉀離子（Ca2+、Mg2+、Na+、K+）等離子的轉運、維持細胞內外正常的滲透壓的功能[12]。研究發現四物湯能夠改善造模后機體中牛磺酸的相對含量的改變，提示四物湯在維持細胞膜穩定方面有一定的作用。丙氨酸是體內重要的非必需氨基酸，有研究顯示丙氨酸是淋巴細胞再生及免疫過程中重要的參與者[13]；谷氨酰胺是體內最豐富的游離氨基酸之一，具有重要的免疫調節作用，是淋巴細胞分泌、增殖及其功能維持所必需的，研究發現在模型組中丙氨酸和谷氨酰胺的含量發生變化，由此推斷輻射造成機體的免疫功能受損，四物湯可以調節機體免疫功能。

綜上所述，輻射損傷所致血虛證的機制可能與機體無氧氧化功能受損、能量代謝和脂類代謝失調、細胞內外滲透壓平衡破壞、機體免疫功能失調有關。經典補血方劑四物湯治療血虛證的機制可能與穩定細胞膜，維持細胞內外滲透壓平衡，調節糖酵解，促進機體正常能量代謝以及增強機體抗氧化能力、免疫力有關，其深入的作用機制還有待進一步探索。

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NMR-spectroscopy-basedmetabonom ic study on themousemodelof blood deficiency syndrome induced by radiation

HUOChao,WANGMu,MA Zeng-chun,etal
（Beijing Institute ofRadiation Medicine，Beijing 100850，China）

[Objection]To explore the essence ofblood deficiency syndrome and themechanism of the effectsof Siwutang based on the characteristic changes in metabolic profiles of C57 mice with blood deficiency induced by radiation before the treatment of Siwutang.[Methods]Thirty C57 mice were random ly divided into three groups of 10 animals:the control group and two blood deficiencymodel groupswithoutorwith Siwutang treatment.The animalswere sacrificed the 7th day after radiation and the blood,spleen,thymusand bone marrow were obtained.Themetabolic profilesofserum,aqueousand lipidic extractsof thymus,spleen and bonemarrow were investigated using 1H nuclearmagnetic resonance spectroscopy(NMR).The NMR spectrawere integrated in segments of 0.01 ppm,normalized and then analyzed using SIMCA-P software to visualize the similarities and differences inmetabolic profiles between these groups.[Results]Compared with the control group,themodelgroup contained different levels of lactate,choline,glucose,taurine,alanine,LDL,glycerin,UFA,creatinine,histidine,valine/leucine/isoleucine.In the Siwutang treated group,the above-mentioned changeswere reversed.[Conclusion]The injury established by radiation wasa kind ofpropermodel to develop furthermetabonomics researches.The disorderofenergymetabolism and osmoregulation，and the damage of immune function were observed by NMR-based-metabonomicsmethod.Siwutang,the classic complex for treating blood deficiency in clinic,could improve the immune function,accommodate energymetabolism and stabilize cellularmembrane.

radiation;Siwutang;blood deficiency;metabonomics;NMR

R285.5

A

1672-1519(2010)03-0233-03

國家自然基金資助項目（30672628，30730112）。

霍 超（1986-），女，碩士，主要從事中藥的代謝組學研究。

2010-01-30）