歸芍清血合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

歸芍清血合劑由生地黃、赤芍、當(dāng)歸、金銀花、黃芩等九味中藥組成。本品清熱解毒，涼血止痛，臨床用于皮膚過(guò)敏、瘙癢等癥。為有效地控制制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)建立了赤芍、當(dāng)歸、金銀花、黃芩的薄層色譜鑒別方法，并采用HPLC法測(cè)定君藥赤芍的主要成分芍藥苷的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 紫外檢測(cè)器，Agilent色譜化學(xué)工作站；Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。XS-104型分析天平(瑞士梅特勒)；芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，110736-200527)，阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110773-200611)，綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110753-200413)， 黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110708-200205)；歸芍清血合劑及陰性對(duì)照品(本院自制)；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 當(dāng)歸的薄層鑒別 取本品20ml，加乙醚振搖提取2次，每次20ml，合并乙醚液(水液備用)，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取不含當(dāng)歸的空白樣品，按供試品溶液制備法制成陰性樣品溶液。分別吸取上述三種溶液各5 μl， 點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷- 乙酸乙酯-甲酸(25∶12∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.1.2 赤芍的薄層鑒別 取“2.1.1”項(xiàng)下乙醚提取后的水液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，正丁醇液蒸干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 ml含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取不含赤芍的空白樣品，按供試品溶液制備法制成陰性樣品溶液。分別吸取上述三種溶液各5μl， 點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.1.3 金銀花的薄層鑒別 取本品20 ml，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 ml，合并提取液，濃縮至0.5 ml，作為供試品溶液。另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取不含金銀花的空白樣品，按供試品溶液制備法制成陰性樣品溶液。分別吸取上述三種溶液各10 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.1.4 黃芩的薄層鑒別 取本品10 ml，加稀鹽酸2滴，用乙酸乙酯提取2次，每次10 ml，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取不含黃芩的空白樣品，按供試品溶液制備法制成陰性樣品溶液。分別吸取上述三種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

2.2 芍藥苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性考察 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(20∶80)，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl。在此色譜條件下，供試品及對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處有吸收峰，而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)位置無(wú)吸收峰，陰性對(duì)照品對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)不低于10000。見(jiàn)圖5～7。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品2.4 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻。取此液加甲醇稀釋成含芍藥苷0.024 g·L-1的溶液， 作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備 精密量取本品2 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取上清液，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液2 ml， 置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，作為供試品溶液；取按處方量除去赤芍制成的陰性對(duì)照品，依照供試品溶液的制備方法所得溶液為陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取0.24 g·L-1的芍藥苷溶液，依次加甲醇稀釋為0.024、0.016、0.008、0.004、0.002 g·L-1的溶液，各取20 μl分別進(jìn)樣，以芍藥苷進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程y=2079.8897x+5.1831，r=0.9994。

結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.04～0.48 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 當(dāng)歸薄層鑒別色譜圖

圖2 赤芍薄層鑒別色譜圖

圖3 金銀花薄層鑒別色譜圖

圖4 黃芩薄層鑒別色譜圖

2.2.5 精密度試驗(yàn) 供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μl， 按上述色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為0.65%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫避光保存，分別于配制后0，2，4，8，12，24小時(shí)進(jìn)樣20 μl測(cè)定計(jì)算，結(jié)果RSD為0.78。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批樣品(070801)6份，分別按樣品測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算樣品中芍藥苷的平均含量為0.797 mg·ml-1，RSD為1.02%。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品溶液(批號(hào) 070801)6份各1.0 ml，置50 ml量瓶中，分別精密加入0.32 g·L-1的芍藥苷對(duì)照品溶液2.0，2.0，2.5，2.5，3.0，3.0 ml，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備，在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖5 芍藥苷對(duì)照品

圖6 樣品

圖7 陰性對(duì)照

表1回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

樣品含量(mg)加入量(mg)測(cè)得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0．7970．641．40494．840．7970．641．43199．060．7970．801．56796．2597．131．180．7970．801．57397．000．7970．961．74498．650．7970．961．72896．98

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

2.2.9 樣品測(cè)定 取歸芍清血合劑樣品3批，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備后分別進(jìn)樣3次，計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

薄層鑒別參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，赤芍經(jīng)水飽和的正丁醇提取后，薄層色譜斑點(diǎn)較清晰；樣品溶液經(jīng)鹽酸處理后用有機(jī)溶劑提取，鑒別黃芩苷，方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。

赤芍有清熱涼血作用，為方中主要成分，因此選擇芍藥苷作為含量測(cè)定指標(biāo)，參考有關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，分別以甲醇和稀乙醇提取樣品，結(jié)果以甲醇超聲提取30分鐘結(jié)果最好，因此選擇甲醇為提取溶劑。

本文建立的薄層鑒別和含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為歸芍清血合劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：422，585.

[2]呂武清，龍新華．中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京：人民衛(wèi)生出版社．1997：291，464.

[3]趙鐵，李玉靈，阮國(guó)虎，等．HPLC法測(cè)定赤丹丸中芍藥苷的含量[J].中國(guó)藥師，2007，10(4)：326-327.

[4]胡雙豐．高效液相色譜法測(cè)定八珍顆粒中芍藥苷含量研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2005，22(6)：492-493.

[5]遲強(qiáng)，欒中山．HPLC測(cè)定暖胃舒樂(lè)片中芍藥苷含量[J].中成藥，2007，29(1)：附3-5.

[6]呂永寧，張玉良，徐楚鴻，等．反相高效液相色譜法測(cè)定疹癢康合劑中芍藥苷的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2004，23(5)：336-337.