枯草芽孢桿菌SH7抑菌蛋白的分離純化及對煙草青枯病菌的抑制作用

張秀玉，孔凡玉，王 靜，張成省，李佰樂

(國家煙草專賣局煙草病蟲害監測與綜合治理重點開放實驗室，中國農業科學院煙草研究所，青島 266101)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為植物病害主要生防細菌之一，廣泛分布于自然界中，因其是對人畜無害、不污染環境的非致病細菌，備受各國研究工作者的青睞。很多優良的枯草芽孢桿菌菌株已經應用于農業生產[1-3]。Bacillus subtilis 在生長代謝過程中能夠產生不同種類的拮抗物質，主要為抗生素和抗菌蛋白[4-5]。國內對Bacillus subtilis及其代謝產物對植物病原菌的生物防治研究也很多，主要對不同 Bacillus subtilis 菌株抗菌蛋白的分離、純化、理化性質及其抑菌機制的研究[6-7]。

從煙草根際土壤分離到 1株對煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有較強拮抗作用的生防細菌SH7(經細菌常規及16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌[8])，且其無菌發酵液對煙草青枯病的溫室盆栽試驗防效較好，并初步證明了該菌產生的拮抗物質為蛋白類物質[9]。本實驗對SH7菌株產生的拮抗蛋白進行分離純化，并初步研究了該抑菌蛋白對Ralstonia.solanacearum的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

拮抗菌株： Bacillus subtilis SH7，分離自煙草根際土壤。

指示菌：Ralstonia solanacearum，來自中國科學院植物保護研究所。

1.2 供試培養基

基礎發酵培養基（NB）：每升水含葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉浸膏3 g，pH 7.0。牛肉膏蛋白胨淀粉培養基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g氯化鈉，2 g淀粉，20 g瓊脂，1000 mL水，pH 7.4。

淀粉酶種子培養基：5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCL，5 g可溶性淀粉，1000 mL水，pH7.0。

淀粉酶發酵培養基：20 g玉米粉，15 g黃豆餅粉，0.2 g氯化鈣，0.2 g硫酸鎂，2.5 g氯化鈉，2g磷酸氫二鉀，0.75 g硫酸銨，2 g磷酸氫二鈉，1000 mL水，pH7.0。

1.3 主要試劑

酵母粉、蛋白胨購自OXOID有限責任公司，DEAE Sepharose Fast Flow購自GE Healthcare公司，Sephadex G-75購自Pahaimacia公司，丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、聚乙二醇 8000購自北京索萊寶科技有限公司，低分子量標準蛋白購自天根生化科技有限責任公司，其余試劑為國產分析純。

1.4 粗提拮抗物的確定

將SH7接種于含100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃振蕩培養48 h，4 ℃下8000 r/min離心15 min去菌體，在上清液中加入硫酸銨至30%,50%, 70%, 90%不同飽和度，將各級沉淀所得蛋白透析脫鹽即為蛋白粗提液，牛津杯擴散法法檢測其對R.solanacearum的活性測定。

1.5 抑菌蛋白的分離純化

1.5.1 抑菌蛋白的分離 將有活性的蛋白粗提液用上樣緩沖液( 0.02 mol/L Tris-HCL, pH 8.0 ) 充分透析后, 進行DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，再用含0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mol/L的氯化鈉的緩沖液進行梯度洗脫，分部收集樣品，透析脫鹽，檢測對煙草青枯病菌的抑菌活性。

1.5.2 抑菌蛋白的純化 將有抑菌活性的收集樣品濃縮再進行Sephadex G-75凝膠過濾層析，用500 mL 0.02 mol/L Tris-HCL洗脫，收集樣品，透析脫鹽后檢測其對煙草青枯病菌的抑菌活性，-25 ℃保存備用。

1.5.3 抑菌蛋白純度與相對分子質量測定 方法參照文獻[10]。聚丙烯凝膠電泳濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，分別在80 V和100 V下做恒壓電泳。染色采用考馬斯亮藍染色法和硝酸銀染色法[11]相結合。

1.6 抑菌蛋白淀粉酶活力的測定

將 1.5.2中具有活性的蛋白利用牛津杯定量擴散法在牛肉膏蛋白胨淀粉培養基上培養24 h，利用革氏碘液(1.0 g碘，2.0 g碘化鉀，300 mL水)顯色法，測定活性蛋白是否具有淀粉酶活性。再用碘量法測定所生成的葡萄糖的含量來計算淀粉酶活力。

1.7 抑菌蛋白對煙草青枯病菌的拮抗作用

在100 mL NB液體發酵培養基的250 mL搖瓶中按 1:20的接種量同時接入抑菌蛋白和煙草青枯病菌，30 ℃搖床中150 r/min培養48 h；同時設相同條件下培養煙草青枯病菌為對照，每處理3次重復；8000 r/min離心 15 min去菌體；以 V(上清液):V(無水乙醇)=1：3加入乙醇，混勻，靜止過夜，在12000 r/min下離心2 min，棄上清，用75%乙醇沖洗沉淀[12]，在50 ℃烘箱中放置6 h，烘干后剩余沉淀即為胞外多糖粗提物，分別測定其質量。

2 結 果

2.1 抑菌蛋白的分離純化

2.1.1 硫酸銨飽和度的確立 抑菌蛋白粗提液經硫酸銨分級沉淀透析脫鹽后，通過對煙草青枯病菌的活性測定，得知在 0～30%沉淀段的蛋白對煙草青枯病菌的抑菌活性最大，而 30%～50%，50%～70%和 70%～90%基本沒有抑菌活性，表明此飽和度沉淀出來的蛋白多為雜蛋白，不含抗菌蛋白，由此確定分級鹽析的飽和度為0～30%。

2.1.2 抑菌蛋白純度與相對分子質量測定 經DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析，對有活性的蛋白進行非變性膠聚丙烯酰胺凝膠電泳，經考馬斯亮藍染色法和硝酸銀染色得單條帶，蛋白的相對分子質量為 33.6 kD (圖 1)。

2.2 抑菌蛋白淀粉酶活力的測定

利用革氏碘液顯色，由圖2可以看出，抑菌蛋白具有淀粉酶活力，是一種胞外蛋白酶。經碘量法測定所生成的葡萄糖的含量來計算淀粉酶的活力為15.76 mg/mL。

圖1 枯草芽孢桿菌SH7純化抑菌蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.1 SDS-PAGE pattern of purified protease from Bacillus subtilis strain SH7

2.3 抑菌蛋白對煙草青枯病菌抑制作用

單獨接煙草青枯病菌得到的胞外多糖含量為0.62 mg/mL，而同時接活性蛋白和煙草青枯病菌得到的胞外多糖含量為0.46 mg/mL，小于單獨接煙草青枯病菌的胞外多糖含量，從而可以看出抑菌蛋白抑制了煙草青枯病菌分泌胞外多糖的量。

3 小 結

本實驗純化了電泳純的SH7分泌的抑菌肽，其相對分子質量為 33.6 kD，且具有淀粉酶的活性，能減少煙草青枯病菌胞外多糖的分泌。對于生防芽孢桿菌產生的抑菌肽類對植物病原菌的拮抗作用，國內外已有較多研究[13-15]，而對其具有淀粉酶活性的研究還較少，SH7分泌的抑菌肽的淀粉酶活力與胞外多糖的減少是否相關有待進一步研究。同時作者已證實SH7菌株對煙草具有促生作用，對其他作物青枯病菌、煙草黑脛病和煙草赤星病菌具有良好的拮抗作用(另文報道)，本實驗為以后對抑菌肽的進一步純化、測序及構建多功能生防菌株奠定了基礎，為SH7菌生防制劑的產業化及田間應用提供了理論依據。

[1]Baker K F.Evolving concepts of biological control of plant pathpgens [J].Ann Rev Phytopathol, 1987(25):67-85.

[2]Asaka O, Shoda M.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Baccilus subtilis RB14[J].Appl Environ Microbiol, 1996, 62 (11): 4081-4085.

[3]陳志誼, 許志剛, 陸凡, 等.拮抗細菌 B-916培養液對水稻紋枯病菌抗生活性及其抗菌物質的研究[J].江蘇農業學報, 2000, 16(3): 148-152.

[4]Moyne A L, Cleveland T E, Tuzun S.Molecular characterization and analysis of the operon encoding the antifungal lipopeptide bacillomycin D [J].FEMS Microbiology Letters, 2004, 234: 43-49.

[5]Ahimou F, Jacques P, Deleu M.Surfactin and iturin A effects on Bacillus subtilis surface hydrophobicity[J].Enzyme and Microbial Technology, 2000, 27: 749-754.

[6]童有仁, 馬志超, 陳衛良, 等.枯草芽孢桿菌B034拮抗蛋白的分離純化及特性分析[J].微生物學報, 1999,39(4): 339-343.

[7]謝棟, 彭憬, 王津紅, 等.枯草芽孢桿菌抗菌蛋白 X98Ⅲ的純化與性質[J].微生物學報, 1998，38(1): 13-19.

[8]王靜, 趙廷昌, 孔凡玉, 等.煙草青枯病拮抗細菌的初步篩選[M]// 農業生物災害預防與控制.北京: 中國農業科學技術出版社, 2005: 801-803.

[9]王靜, 趙廷昌, 孔凡玉, 等.SH7對煙草青枯病的抑菌、防病作用及其抑菌物質的初步研究[J].中國煙草科學,2007, 28(2): 41-44.

[10]汪家政，范明.蛋白質技術手冊[M].北京:科學出版社，2000.

[11]Nesterenko M V, Tilley M, Upton S J.A simple modification of Blum’s silver stain method allows for 30 minute detection of protein in polyacrylamide gels [J].Biochem Biophys Methods, 1994, 28 (3):239-242.

[12]程紅兵, 任盛, 謝紅, 等.細菌胞外多糖提取優化及毒性試驗研究[J].中國生物工程雜志, 2008, 28(3): 74-78.

[13]Melentev A I, Aktuganov G E, Galimzyanova N F.The role of chitinase in the antivity of Bacillus sp.739[J].Microbiology, 2001, 70(5): 548-552.

[14]Martin D F, Priest F G, Todd C, et al.Distribution of beta-glucanases within the genus Bacillus [J].Appl Environ Microbiol, 1980, 40(6): 1136-1138.

[15]邢介帥, 李然, 趙蕾， 等.生防芽孢桿菌T2胞外蛋白酶的純化及其抗真菌作用[J].植物病理學報, 2008,38(4): 377-381.