丹參脂溶性成分提取方法研究

2010-05-26 06:14:24楊千才柳仁民

中成藥 2010年4期

楊千才，柳仁民

（聊城大學化學化工學院，山東聊城 252059）

丹參為唇形科植物丹參Salviae miltiorrhizaeBge.的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩的功效［1］，是治療心腦血管疾病的傳統中藥材。現代研究發現丹參的化學成分主要分為脂溶性成分及水溶性成分兩大類，脂溶性成分主要為二萜類化合物，如隱丹參酮、丹參酮 IIA、丹參酮 I等［2，3］;水溶性成分主要為酚酸性化合物，如丹參素、原兒茶酸、丹酚酸B等［4，5］。丹參酮類化合物是丹參的脂溶性主要成分，在生物體內的代謝產物由于參與機體的多種生物化學反應而表現出多種藥理作用，對心腦血管疾病、肝炎、白血病等具有潛在的治療作用［6，7］。

有關丹參酮的提取工藝文獻報道很多［8-10］，然而大都是以極性較大的乙醇作為提取溶劑，結果導致提取物中水溶性成分含量高，而丹參酮的相對含量較低，不利于后續對丹參酮的分離純化。本試驗考慮使用極性較小的提取溶劑，不但對于丹參酮類脂溶性成分會有較好的提取效果，而且會大大降低提取物中水溶性成分的含量，這樣水溶性成分更多的留在了藥渣內，也更有利于進一步對藥渣中水溶性成分的提取，達到綜合提取丹參有效成分的目的。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），包括G1311A四元泵，G1315B陣列二極管檢測器，Rheodyne7225i定量進樣閥，G1322A在線真空脫氣機，Agilent HPLC化學工作站。

UV-2100紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司），FZ102微型植物粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司），AR-1104D電子天平（奧克斯國際貿易上海有限公司），SK3300LH超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司），RE-52旋轉蒸發器（上海青浦滬西儀器廠），HH-6數顯恒溫水浴器（常州國華電器有限公司）。

1.2 試劑與藥材乙酸乙酯、二氯甲烷為分析純（天津市化學試劑三廠），95%乙醇（山東廣源醫藥酒精有限公司），HPLC所用甲醇為色譜純（Tedia Company，USA），水為過濾的蒸餾水。

隱丹參酮與丹參酮IIA對照品為本實驗室從丹參根中分離純化制得，經HPLC測定純度均大于99%，結構經1HNMR與13CNMR得以鑒定。

丹參藥材購于聊城市中醫醫院，經山東中醫藥大學張永清教授鑒定為正品藥材。

2 實驗方法

2.1 色譜條件色譜柱:Spherigel C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連江申分離科學技術公司）;流動相:甲醇-水（75∶25，v/v）等度洗脫;流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm;溫度:室溫;進樣量:20 μL。在此色譜條件下，丹參酮類成分可以獲得較好的分離，隱丹參酮、丹參酮IIA對照品溶液及丹參粗提物的色譜圖如圖1所示。

2.2 標準曲線的制備

2.2.1 供HPLC測定用標準曲線的制備分別準確稱取隱丹參酮對照品4.0 mg，丹參酮IIA對照品5.6 mg，置50 mL量瓶中，加適量甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度分別為隱丹參酮80 μg/mL，丹參酮IIA112 μg/mL的對照品溶液。精密吸取對照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、7.0 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻;分別精密吸取20 μL，依次進樣，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程:隱丹參酮:Y=40.933X+48.154，r=0.999 7;丹參酮 IIA:Y=24.533X+80.923，r=0.999 9。結果表明，隱丹參酮、丹參酮 IIA分別在 8～56 μg/mL、11.2～78.4 μg/mL的濃度范圍內線性關系良好。

圖1 隱丹參酮（A）、丹參酮IIA（B）及丹參粗提物（C）的色譜圖

2.2.2 供總丹參酮測定用標準曲線的制備精密稱取60℃減壓干燥至恒重的丹參酮IIA對照品1.2 mg，置10 mL量瓶中，用氯仿溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.112 mg/mL的丹參酮IIA對照品溶液。精密吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.7 mL，置于 10 mL量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，使濃度分別為1.12、2.24、4.48、6.72、7.84 μg/mL，以氯仿為空白，于波長271 nm處測定吸光度。以吸光度（A）對濃度（C）進行一元線性回歸，得回歸方程為:A=0.086C+0.003，r=0.999 7，結果表明丹參酮IIA對照品在1.12～7.84 μg/mL的濃度范圍內呈線性關系。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 供HPLC測定用樣品溶液的制備丹參藥材粉碎過30目篩，混合均勻。準確稱取丹參粉末適量，加入一定量的溶劑，用不同的方法提取，提取液過濾，減壓濃縮至干，得到丹參酮粗提物。稱取適量粗提物，用甲醇溶解并定容至一定體積，經0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.3.2 供總丹參酮測定用樣品溶液的制備準確稱取2.3.1項下方法制備的丹參酮粗提物適量，用氯仿溶解并定容至一定體積，得供試品溶液。

2.4 樣品含量測定

2.4.1 HPLC法測定樣品中丹參酮IIA和隱丹參酮的含量精密量取2.3.1項下方法制備的樣品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，代入標準曲線計算含量。

2.4.2 紫外分光光度法測定樣品中總丹參酮含量取2.3.2項下方法制備的樣品溶液于271 nm處測定溶液的吸光度，代入標準曲線計算總丹參酮的含量。

3 結果與討論

3.1 提取溶劑與提取方法的選擇使用超聲和回流兩種提取方法，以總丹參酮、隱丹參酮和丹參酮IIA為評價指標，用分光光度計和HPLC進行分析測定，在提取時間、液固比相同的條件下比較了95%乙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷三種極性各不相同的溶劑對丹參酮類成分的提取效果，結果列于表1中。

從表1可見提取溶劑對丹參酮的提取效果有很大的影響。當使用極性較大的乙醇作為提取溶劑時，由于選擇性不高，盡管丹參酮的絕對量較高，但是由于極性大的丹酚酸類成分的溶出量也最高，因此導致提取液中丹參酮的相對含量降低。當采用極性較小的乙酸乙酯或二氯甲烷作為提取溶劑時，由于此時水溶性成分溶出量降低，因此丹參酮的相對含量明顯提高。鑒于二氯甲烷的毒性較強，乙酸乙酯為最佳提取溶劑。另外提取方法對丹參酮的提取效果也有較大的影響，使用乙酸乙酯回流提取所得丹參酮的量多于超聲提取，這是由于丹參酮的溶解度隨溫度升高而增大。故而最終確定乙酸乙酯熱回流為丹參脂溶性成分的最優提取方法。

表1 不同的提取溶劑和方法對丹參酮類成分的提取效果（n=3）

3.2 單因素試驗及結果

3.2.1 液固比的選擇乙酸乙酯為提取溶劑，回流提取時間為0.5 h，液固比（mL/g）分別為3∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10 ∶1、20 ∶1，室溫條件下考察液固比對丹參藥材中丹參酮提取率（mg/g）的影響，結果（n=3）見圖2。

圖2 液固比對提取率影響

由圖2可知，隨液固比的增加，丹參藥材得到完全浸潤，使得有效成分很好地溶出，當液固比為8:1時，隱丹參酮和丹參酮IIA的提取率達最大值;此后，隨液固比的增加，提取率略有下降。考慮到溶劑利用的經濟效益，在合適的范圍內選擇較小的液固比較合適。

3.2.2 提取時間的選擇乙酸乙酯為提取溶劑，液固比為8 ∶1，回流提取時間分別為 0.5、1 h、1.5、2 h，室溫條件下考察提取時間對丹參藥材中丹參酮提取率（mg/g）的影響，結果（n=3）見圖3。

圖3 提取時間對提取率影響

由圖3可知，隨著提取時間的增加，隱丹參酮收率變化不大，而丹參酮IIA在1.5 h之后收率有明顯下降的趨勢。這是因為丹參酮IIA不穩定，在長時間的提取過程中會轉化分解［11］，故選擇較短的回流時間更為合適。

3.2.3 提取溫度的選擇乙酸乙酯為提取溶劑，液固比為8∶1，回流提取時間為0.5 h，提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，室溫條件下考察溫度對丹參藥材中丹參酮提取率（mg/g）的影響，結果（n=3）見圖4。

圖4 溫度對提取率影響

由圖4可知，從60℃到70℃，隨溫度升高，丹參酮的提取率緩慢上升，70℃時達極大值，而超過70℃，卻有較明顯的下降，這是由于丹參酮類成分的穩定性受濕熱影響很大，溫度過高，丹參酮發生分解所致［12，13］，所以加熱溫度控制在70℃比較合適。3.2.4 提取次數的選擇乙酸乙酯為提取溶劑，液固比為8∶1，回流提取時間為0.5 h，提取溫度為70℃，分別提取1、2、3和4次，室溫條件下考察提取次數對丹參藥材中丹參酮提取率（mg/g）的影響，結果（n=3）見圖5。