單味及復方中藥的雙頻復合超聲提取效果對比研究

賁永光， 丘泰球， 李 康

（1.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州 510006;2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640）

關于用超聲提取中藥復方的文獻報道非常少見，現有的文獻報道中，絕大多數采用單頻輻照方式。有關雙頻超聲輻照的聲化學反應規律的基礎研究則是近年來的事，因其顯著地增加空化事件，減少駐波所造成的死角，提高聲化學產額，它已引起國際上不少研究單位的濃厚興趣。朱昌平［1］等用碘釋放法研究了28 kHz分別與0.87 kHz、1.06 kHz，1.7 kHz組成的雙頻超聲輻照的聲化學效應。發現雙頻輻照增大聲化學產額存在著明顯的頻率效應。沈壯志［2］等研究雙低頻超聲輻射對碘化鉀溶液碘釋放量影響的研究，結果表明雙頻輻射碘釋放量約為單頻的2倍，有的甚至高達5倍左右。曹雁平［3］等采用均勻設計研究28 kHz和40 kHz單頻超聲、雙頻組合超聲（先28 kHz超聲接著40 kHz超聲）和雙頻復合超聲（28 kHz超聲和40 kHz超聲同時工作）浸提綠茶多酚，結果表明:雙頻復合超聲浸取綠茶茶多酚在濃度、浸取率和浸取速率三個方面都優于單頻超聲和雙頻組合超聲。在所研究的各種頻率組合情況下，雙頻同時輻照的綜合效應均明顯大于各頻率單獨輻照效應。徐飛［4］等用超聲提取復方六味地黃丸，研究發現超聲提取效果明顯優于回流提取法，具有省時、省工、提取率高等特點。目前用雙頻復合超聲提取技術對中藥復方進行提取工藝的研究及新藥開發還是一個空白。超聲技術提取中藥具有提取效率高、低溫、省時、節能等優點，但目前幾乎局限于單味中藥的提取，而中醫用藥多以復方制劑為主，藥物發揮的是多成分、多靶點的綜合治療作用，使超聲技術受到了限制，中藥復方采用雙頻復合超聲提取技術目前還是個空白。

本實驗選擇單味藥丹參、單味藥三七及由丹參和三七兩味藥組成的復方丹參三七作為研究對象，采用雙頻復合超聲（25 kHz/40 kHz）強化提取單味藥及復方中藥有效成分，并對單味藥和復方中藥的雙頻復合超聲提取效果進行檢驗分析。

1 儀器和材料

1.1 材料

丹參（批號:021116）和三七（批號:200207）藥材（廣州漢方現代中藥研究開發有限公司提供），丹參酮ⅡA標準品（批號:110766－200314）和人參皂苷 Rg1（批號:0703－200120）對照品（中國藥品生物制品檢定所）;乙醇、甲醇、乙醚均為分析純。

1.2 儀器

超聲波清洗槽（槽式超聲，40 kHz，功率可調）;探頭式超聲波處理機（25 kHz，功率可調）;雙頻復合超聲化學反應器（自制）;本實驗雙頻復合超聲裝置為探頭式超聲與槽式超聲組合而成，25 kHz和40 kHz超聲同時開啟并作用于提取對象。HH－6恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）;RE－52CS旋轉蒸發器（鞏義市英峪予華儀器廠）;予華牌循環水真空泵（河南省鞏義市英峪予華儀器廠）;UV1101紫外/可見分光光度儀（上海天美科學儀器有限公司）;JA2003電子天平（上海恒平科學儀器有限公司）;日本島津LC10ATVP型液相色譜儀。

1.3 雙頻復合超聲操作方法

雙頻復合超聲操作:25 kHz和40 kHz超聲同時開啟，40 kHz是槽式超聲，連續發射超聲，而25 kHz超聲是探頭式超聲，作用5 s，停5 s，為保證40 kHz和25 kHz超聲同步作用，40 kHz超聲作用時間結束，25 kHz超聲作用時間也結束，即同時停止超聲。單頻超聲操作:比如40 kHz超聲單頻作用，實驗裝置與雙頻復合超聲相同，與雙頻復合超聲操作所不同的是:只開啟40 kHz超聲，而不開啟25 kHz超聲，目的是保持40 kHz超聲產生的聲場和雙頻復合超聲中40 kHz超聲產生的聲場是一致。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

丹參酮ⅡA的色譜條件:儀器為waters2695/2996，色譜柱為 Hypersil ODS 5 μm，250 mm ×4.6 mm，檢測波長 270 nm，流動相為水－甲醇（25∶75），柱溫30℃，流速1 mL/min，分析時間 25 min，進樣量 5 μL。

人參皂苷Rg1色譜條件:儀器為waters2695/2996，色譜柱為 Hypersil ODS 5 μm，250 mm ×4.6 mm，檢測波長 203 nm，流動相為0.05 mol/L磷酸水溶液－乙腈（81∶19），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，分析時間 60 min，進樣量 10 μL。

2.2 標準品溶液的制備

人參皂苷Rg1對照品溶液的制備:取對照品人參皂苷Rg1適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液作為對照品溶液。

丹參酮ⅡA對照品溶液的制備:對照品丹參酮ⅡA適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含16 μg的溶液作為對照品溶液。

2.3 標準曲線制備

分別精密吸取不同體積的丹參酮ⅡA對照品貯備液，用甲醇稀釋調配成系列對照品溶液，分別進樣5 μL，測定峰面積積分值。以丹參酮ⅡA濃度C（mg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=5.73×106x－3.62×104，r=0.999 9，丹參酮ⅡA在濃度為 0.007 4～0.222 0 mg/mL范圍內線性關系良好。

分別精密吸取不同體積的人參皂苷Rg1對照品貯備液，用甲醇稀釋調配成系列對照品溶液，分別進樣10 μL，測定峰面積積分值。以人參皂苷Rg1濃度C（mg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=3.31×105X－4.39×104，r=0.999 7，人參皂苷 Rg1在濃度為0.080～1.620 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.4 提取率的計算

按照復方配比（丹參/三七為4∶1）準確稱取丹參粉末2.0 g，三七粉末0.5 g，將丹參和三七混勻。置索氏提取器中，加乙醚80 mL，水浴上提取2 h，取出，棄去乙醚液，再加甲醇80 mL提取4 h，提取液抽濾定容，按2.3項方法測定，計算提取液有效成分的含量，并以此計算出各處理的有效成分提取率。

2.5 單頻和雙頻復合超聲提取單味藥及復方中藥有效成分提取率對比

根據單頻超聲和雙頻復合超聲提取單方及復方工藝條件，本實驗在此條件下進行，即乙醇濃度95%，物料粒徑80～100目，固液比1∶15，提取時間40 min，提取溫度30℃，其中藥材量丹參為2 g，三七為0.5 g。結果見表1。

表1 在不同方法下提取單味藥及復方中藥有效成分提取率

從表1可以看出不同提取方法對單味藥提取時的有效成分的提取率均低于復方提取時的提取率，對于單頻和雙頻提取來說，整體效果更加突出，這就表明了單頻，雙頻復合超聲提取復方丹參三七的效果優于單味藥提取，對于這樣的結果，從整體上看可以推測有幾種可能的原因:第一，當復方超聲提取時，可能是因為提取了的丹參酮ⅡA成分增強了超聲對人參皂苷Rg1提取的能力，或者是提取了的人參皂苷Rg1成分增強了超聲對丹參酮ⅡA提取的能力;第二，中藥復方有效成分比較多而且復雜，某些成分之間可能產生協同或者是互溶作用，從而導致目標成分提取率的提高。第三，由于超聲的強剪切作用對復方藥材粉末進一步粉碎到更細小的粒徑，從而增加傳質表面積，使得傳質速率提高。另外，從表中可以看出，雙頻復合超聲的提取效果又優于單頻超聲的提取效果，這可能由于雙頻復合超聲產生的協同作用使得液體中的空化泡的數量增加，使得空化事件增多。另一方面，由于超聲發生空化時，在極短的時間、極小的空間內可產生50 MPa以上的高壓，這足以引起空化點附近的溶劑形成超臨界狀態，這樣使得復方中的溶質在溶劑中的溶解度顯著增大，導致溶質在常態下變為過飽和，從而使傳質推斷力變大，從而從整體上能強化傳質速率。

2.6 利用統計學的方法對雙頻復合超聲提取單方及復方丹參三七的效果進行檢驗

為了檢驗雙頻復合超聲對復方丹參三七及單味丹參和單味三七的提取效果數據之間的差異是否因為試驗過程中的測試誤差或者時其他原因而導致的，我們可以利用統計學中的平均值檢驗方法對它們進行顯著差異性檢驗［5］。就是檢驗在同樣的超聲條件提取下，測得的單方提取和復方提取有效成分的兩組提取率是否有顯著性差異，如果有兩組數據有顯著性差異，則說明超聲提取復方和單方的效果是不一樣的，否則，可以說明超聲提取復方和單方的效果沒有差異性，也就是復方和單方的超聲提取效果沒有明顯的差異。

根據雙頻復合超聲提取單方及復方工藝條件，本實驗在此條件下進行，即乙醇濃度95%，物料粒徑80～100目，固液比1∶15，提取時間40 min，提取溫度30℃，其中藥材量丹參為2 g，三七為0.5 g。每次實驗重復做5次。雙頻復合超聲提取單味丹參、三七及復方得出的丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1含量均用HPLC進行測定，測定結果見圖1及表2。

從圖1可以看出，雙頻復合（25 kHz/40 kHz）提取復方時的目標成分丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1的提取率均高于單味丹參和單味三七的目標成分。從表2可以看出，對A組和B組、C組和D組進行顯著差異性檢驗結果可知，A組和B組、C組和D測定的結果都存在顯著性差異，說明了超聲提取復方丹參三七和單味藥丹參及單味藥三七的效果是不一樣的，而且雙頻復合超聲提取的復方丹參三七的有效成分的效果優于單味藥丹參和單味藥三七。通過這樣的比較，我們可以知道，單味藥丹參和單味藥三七混合起來提取（也可以說為整提）所得的有效成分提取率高于各單味藥提取（也可以說為分提），另外，由于超聲提取具有低溫的優點，有效成分不會發生分解，從而保持了有效成分的活性。

圖1 以丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1為指標的單方及復方的雙頻復合超聲提取

3 討論

目前超聲提取技術應用于中藥材的提取具有很多優點，但是這些大部分只是針對單味藥材的提取。中藥復方是中醫用方處藥的一大特點，不同的藥材組織結構，具有不同的最佳提取參數，而不同的有效成分，也有不同的最佳提取參數。中藥復方由多味藥組成，方中每味藥都有可能具備不同的組織結構，且其所含有效成分多而復雜，應用超聲技術能否將其最大限度的提取出來，是否也具有省時、省工、高效等優點，還需大量的實驗研究表明，但這些目前尚未有公開的研究報道。本實驗就是針對此問題進行的研究，但只進行了一類中藥復方（復方丹參三七）的超聲提取研究，研究結果表明:從提取效率方面來說，雙頻復合超聲對復方丹參三七中的兩種有效成分丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1的提取效果是很好的，說明了超聲技術同樣適用于該類復方。

從本實驗可以看出，超聲提取丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1的影響工藝參數及規律是相似的，這與它們的物理性質也許會有一定的關系，而且這些有效成分在乙醇溶劑中的溶解度都是很大的，這就有利于提取溶劑的選擇，從而更有利于進行整體提取，而且也利于將復方中的有效成分盡可能的全部提取出來。另外復方中的有效成分比較多，而且復雜，針對不同的有效成分，運用單頻超聲要將其全部有效成分提取出來是困難的，隨著超聲波技術的發展，雙頻、多頻或者可調頻超聲波技術為解決這一問題提供了可能。當然，復方中藥本身作用機制就很復雜，而且各有效成分之間會產生互溶或者發生反應，這些因素都會對中藥復方的提取有一定的影響，因此要找到超聲提取技術在中藥復方中的應用范圍，確定其的適用性，還需要大量的中藥復方超聲提取研究。此外，超聲技術用于中藥復方的工業化大生產，是否也具可行性，更需要進一步的研究。

表2 雙頻復合超聲提取單味藥和復方丹參三七的有效成分提取率對照分析

［1］朱昌平，馮 若，陳兆華，等.雙頻輻照的聲化學產額及其頻率效應的研究［J］.南京大學學報，1998，34（1）:93－96.

［2］沈壯志，尚志遠.雙低頻超聲輻射對碘化鉀溶液碘釋放量影響的研究［J］.陜西師范大學學報（自然科學版），1999，27（1）:51－53.

［3］曹雁平，李建宇，朱桂清，等.綠茶茶多酚的雙頻超聲浸取研究［J］.食品科學，2004，25（10）:139－144.

［4］徐 飛，尹蓉莉，鐘 玲，等.超聲提取六味地黃丸復方的工藝研究［J］. 時珍國醫國藥，2006，17（8）:1431－1433.

［5］鄧 勃.分析測試數據的統計處理方法［M］.北京:清華大學出版社.1995:78－80.