定坤丸質量標準研究

郭巧技， 劉吉金， 黃從瑋

（1.深圳市藥品檢驗所，廣東 深圳 518057;2.廣東藥學院，廣東廣州 510006）

定坤丸為西洋參、白術、茯苓等二十七味藥材組成的成方制劑，具有補氣養血，舒郁調經的功效，用于沖任虛損，氣血兩虧，身體瘦弱，月經不調，經期紊亂，行經腹痛，崩潰不止，腰酸腿軟。原標準僅收載丸劑的通則檢查，為了提高中成藥的檢測標準，增加了當歸、川芎、佛手、白芍、黃芪、西洋參和延胡索的薄層鑒別，增加西洋參的含量測定。

1 儀器與材料

儀器:戴安P680A高效液相色譜儀，PDA-100檢測器;賽多利斯CP224S電子天平;梅特勒-托利多XS205電子天平;AS20500A天津奧特恩斯超聲波清洗儀（功率500 W，40 kHz）。

樣品與試劑:人參皂苷Re（批號110754-200421）、人參皂苷Rb1（批號110704-200420）、人參皂苷Rg1（批號110703-200424）、擬人參皂苷F11（批號110841-200404）、芍藥苷 （批號110736-200731）、黃芪甲苷 （批號110781-200631）、延胡索乙素（批號110726-200409）對照品，當歸（批號120927-200613）、川芎（批號 129018-200406）、白芍（批號 120905-200508）、佛手（批號120933-200303）、延胡索（批號120928-200604）對照藥材均由中國藥品生物制品檢定所提供;硅膠G預制板為MACHERKEY-NAGEL生產（批號:704/356）;定坤丸及處方中的二十七味中藥材均由吉林鹿王制藥有限公司提供。水為超純水，乙腈為色譜純，實驗中所用的其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 當歸、川芎、佛手的薄層色譜鑒別

2.1.1.1 供試品溶液制備 取本品36 g，剪碎，加硅藻土30 g，研勻，加乙醚60 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干（藥渣備用），殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.1.2 對照藥材溶液制備 分別取當歸、川芎、佛手對照藥材各0.5 g，分別加乙醚20 mL，與同法制備對照藥材溶液。

2.1.1.3 陰性對照溶液制備 按處方及制法，分別制成缺當歸、川芎、佛手的陰性對照樣品，取相當于供試品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.1.1.4 當歸、川芎的薄層色譜測定 吸取上述相應溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視（見圖1）。

圖1 川芎、當歸TLC圖

圖2 佛手TLC圖

2.1.1.5 佛手的薄層色譜測定 吸取上述相應溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視（見圖2）。

2.1.2 白芍的薄層色譜鑒別

2.1.2.1 供試品溶液制備 取當歸、川芎鑒別項下用乙醚提取后的藥渣，加乙醇60 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次15 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2.2 對照品溶液制備 取芍藥苷對照品，加無水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2.3 對照藥材溶液制備 另取白芍對照藥材0.5 g，與供試品溶液同法制備對照藥材溶液。

2.1.2.4 陰性對照溶液制備 按處方及制法，制成缺白芍的陰性對照樣品，取相當于供試品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.1.2.5 白芍的薄層色譜測定 吸取上述相應溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視（見圖3）。

圖3 白芍TLC圖

圖4 黃芪TLC圖

2.1.3 黃芪、西洋參薄層色譜鑒別

2.1.3.1 供試品溶液制備 取本品36 g，剪碎，加硅藻土20 g，研勻，加乙醚60 mL，超聲處理30 min，濾過，棄去濾液，濾渣揮干溶劑，加水飽和過的正丁醇60 mL超聲處理60 min，濾過，取濾液，用氨試液洗滌兩次，每次20 mL，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次15 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3.2 對照品溶液制備 取黃芪甲苷，人參皂苷Rb1，人參皂苷Re，人參皂苷Rg1，擬人參皂苷F11，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3.3 陰性對照溶液制備 按處方及制法，制成缺黃芪、西洋參的陰性對照樣品，取相當于供試品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.1.3.4 黃芪的薄層色譜測定 吸取上述相應溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視（見圖4）。

2.1.3.5 西洋參的薄層色譜測定 吸取上述相應溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視（見圖5）。

圖5 西洋參TLC圖

圖6 延胡索TLC圖

2.1.4 延胡索的薄層色譜鑒別

2.1.4.1 供試品溶液制備 取本品12 g，剪碎，加硅藻土6 g，研勻，加 70%乙醇50 mL，超聲處理 3 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，加濃氨試液調節pH至11，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.4.2 對照品溶液制備 取延胡索乙素，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.4.3 對照藥材的制備 取延胡索對照藥材0.2 g，按供試品溶液制備方法，同法制得對照藥材溶液。

2.1.4.4 陰性對照溶液制備 按處方及制法，制成缺延胡索的陰性對照樣品，取相當于供試品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.1.4.5 延胡索的薄層色譜測定 吸取上述相應溶液各10 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（9∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中約3 min后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365 nm）下檢視（見圖6）。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Alltima HP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相:乙腈-水梯度洗脫，0 ～33 min（19 ∶81），33～35 min（19∶81→40∶60），35～42 min（40∶60），42～45 min（19∶81），檢測波長為203 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 取人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，剪碎，精密稱定，再精密加入半量的硅藻土，粉碎，過三號篩，取約12 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入二氯甲烷適量，加熱回流3 h，棄去二氯甲烷提取液，殘渣揮干，再置索氏提取器中，加入甲醇70 mL，加熱回流提取至無色，甲醇提取液蒸干，殘渣趁熱加水40 mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取5次（20、20、15、15、10 mL），合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL。合并洗滌過的氨試液，用水飽和正丁醇提取2次，每次10 mL。合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次15 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，加甲醇轉移至25 mL量瓶中，并加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 線性關系 精密吸取不同濃度的人參皂苷Re對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品的濃度（mg/mL）為橫坐標，測得的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程:Y=0.089 8X+0.107 9，r=0.999 5。結果表明，人參皂苷Re對照品濃度在20.56～1 028 μg/mL之間與其峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取人參皂苷Re對照品溶液（0.1 mg/mL）10 μL，注入液相色譜儀，重復進樣5次，測定峰面積，以人參皂苷Re的峰面積計算，RSD為0.75%，表明本方法精密度良好。

2.2.6 專屬性 精密吸取人參皂苷Re對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按含量測定的方法測定。結果未見陰性對照溶液對試驗有干擾（見圖7）。

圖7 對照品（A）、供試品（B）、陰性對照樣品（C）色譜圖

2.2.7 重復性考察 取同一批供試品6份，按含量測定方法測定。結果人參皂苷Re含量平均值為0.29 mg/g，RSD為3.3%，表明重復性良好。

2.2.8 回收率試驗 取同一批已知含量的供試品6份，分別精密加入一定量的人參皂苷Re對照品，按含量測定方法測定，結果見表1。

表1 人參皂苷Re回收率試驗測定結果

2.2.9 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，按含量測定方法，分別在制備后 0、5、10、15、20、25、30 h 進樣測定。結果測得的人參皂苷Re峰面積的RSD=0.5%，表明供試品溶液自制備后30 h內基本穩定。

2.2.10 樣品的測定 取本品3批，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果見表2。

表2 樣品測定結果（n=4）

3 討論

3.1 參考《中國藥典》2005年版一部當歸、川芎、佛手的鑒別，本試驗采用乙醚超聲提取其脂溶性成分進行鑒別并考察方法學，結果表明當歸、川芎雙陰性對照溶液、佛手陰性對照溶液對供試液均無干擾;黃芪中的黃芪甲苷、西洋參中的人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1及擬人參皂苷F11均為皂苷類物質，因此采用常用的皂苷提取方法進行同步提取，更方便快捷。西洋參薄層鑒別中比較了在不同的濕度環境展開，結果表明低濕度展開效果更好。作者還考察了不同色譜條件下五味子的薄層色譜鑒別，結果層析效果不理想，未收入正文。

3.2 參照文獻方法［1-4］，曾分別考察了二氯甲烷脫脂后甲醇索氏提取法、乙醚脫脂后正丁醇超聲提取法、正丁醇超聲提取法、正丁醇加熱回流法等提取方式，結果以二氯甲烷脫脂后甲醇索氏提取法提取最完全。考察了不同流動相條件，最終得到了正文2.2.1項下優化的流動相條件，此條件下人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離度為1.96，人參皂苷Re峰的理論板數為8 643，待測峰人參皂苷Re出峰后使用梯度可將極性小的雜質洗脫出來，防止影響下一針。

3.3 用二極管陣列檢測器同時采集人參皂苷Re對照品及供試品的紫外吸收光譜，結果對照品峰及供試品峰保留時間及紫外吸收光譜一致。供試品的峰純度因子為988，大于閾值970，表明峰純度良好。

［1］張 寧，張 麗.HPLC測定頸康膠囊中人參皂苷Rg1、Rb1與三七皂苷 R1的含量［J］.中成藥，2008，30（2）:215-216.

［2］中國藥典［S］.一部.2005:87.

［3］張小平，徐世杰.梯度洗脫高效液相色譜法測定三七片中三七總皂苷的含量［J］.中國現代應用藥學雜志，2006，23（3）:219-221.

［4］石俊英，牟彩萍.西洋參微粉加工與人參皂苷Rb1含量的相關性研究［J］.中成藥，2004，26（7）:556-558.