高效液相色譜法測定甘草中4種黃酮類化合物

卓 越， 王新春， 甘永祥， 張 華， 邊海旭， 陳 文

（1.教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點實驗室，新疆石河子 832002;2.新疆石河子大學醫學院一附院，新疆石河子 832008;3.武警新疆森林總隊，新疆烏魯木齊 830013）

甘草中的黃酮類成分是近年來的研究熱點［1］。其中甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素是甘草中的4種重要黃酮類化合物，近年研究發現甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素是抗HIV的有效成分，對其提取分離工藝和臨床研究日益受到國內外學者的重視［2］。

目前，用高效液相色譜法測定天然產物中甘草黃酮類化合物已有文獻報道［3-7］，但主要是測定甘草及其產品中的其中2種或3種成分含量。對這4種黃酮類化合物含量的同時測定，尤其是對甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素的同時測定尚未見文獻報道。為此，本試驗建立了同時測定甘草中4種黃酮類化合物的高效液相色譜法，簡便、快捷、重現性好。

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜儀，Delta 600泵，2996型DAD二極管陣列紫外檢測器（美國沃特斯公司）;Sartorius BP211D型電子天平（美國）;TP300超聲波提取器（北京天鵬電子新技術有限公司）;EZM505201冷凍干燥儀（Crawley England）;乙腈（色譜純），自制雙蒸水，其余試劑均為分析純。

甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素對照品（中國藥品生物制品檢定所）;甘草購于新疆石河子市一附院藥劑科，由石河子大學藥學院成玉懷高級實驗師鑒定為烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）。

2 實驗方法

2.1 甘草總黃酮提取純化與富集 甘草95%乙醇回流提取液濃縮成稠膏狀，石油醚、乙酸乙酯依次萃取3次，乙酸乙酯萃取液用5%Na2CO3和濃鹽酸堿提酸沉后，再用乙酸乙酯萃取并減壓濃縮，60℃恒溫干燥至恒量得棕黃色甘草總黃酮類化合物。將其配成1.5 mg/mL的藥液，pH值調至5.0，以3 mL/min速度的上樣使AB-8型大孔吸附樹脂吸附達到飽和，80%的乙醇溶液洗脫。洗脫液濃縮、冷凍干燥得總黃酮含量為53.15%微黃色粉末備用。

2.2 甘草總黃酮樣品液的制備 精密稱取甘草總黃酮的凍干粉末2.03 mg于10 mL量瓶中，甲醇定容搖勻，即得。

2.3 對照液的制備 精密稱取甘草苷10.42 mg、異甘草苷8.88 mg、甘草素2.78 mg、異甘草素3.07 mg分別于25 mL量瓶中，甲醇定容搖勻，即得。

2.4 色譜條件［3-7］色譜柱:HC-C18ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相A為0.04%甲酸溶液，B為乙腈，作梯度洗脫，梯度洗脫條件:0～15 min，B%為25% ～35%;15～40 min，B%為35%;檢測波長為292 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min;進樣量為20 μL。

2.5 檢測波長的選擇［3-7］甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素都屬于黃酮類化合物，母核相同，性質相似，經DAD檢測器檢測在292 nm處4種黃酮類化合物對照品各峰面積比例適中且均有較高的響應值。見圖1。

圖1 混合對照品在292 nm處的圖譜

2.6 標準曲線的制備［4］分別精密吸取4種對照液甘草苷120 μL、甘草素 34 μL、異甘草苷 110 μL、異甘草素 39 μL 于10 mL量瓶中。再分別精密吸取這4種對照液起始體積的2、3、4、5、6、7、8、9 倍，并分別注入各量瓶中，甲醇定容搖勻。精密吸取各濃度的混合對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按照2.4項下方法測定各濃度對照品峰面積，其線性回歸方程及相關系數分別為:甘草苷y=57 623x－16 755，r2=0.999 3;異甘草苷y=53 892x－6 369.6，r2=0.999 1;甘草素y=348 900x+8 458.4，r2=0.999 8;異甘草素y=138 884x+27 344，r2=0.999 4。甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素的線性范圍分別為 5 ～36 μg/mL，3 ～28 μg/mL，0.3 ～2.7 μg/mL 和0.4 ～3.4 μg/mL。

2.7 精密度試驗［6］精密吸取混合對照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，測定各自的峰面積，計算得甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素對應的RSD分別為1.05%、2.27%、2.64%和1.55%，表明該方法精密度良好。

2.8 重復性實驗［6］取甘草樣品6份，按2.2項下方法制備甘草乙醇提取液，平行進樣2次，按2.4項下方法測定，并用外標法計算，甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素對應的RSD分別為0.31%、2.12%、2.67和3.11%，表明此方法重現性良好。

2.9 穩定性試驗［6］精密吸取同一供試品溶液，分別在4、8、12、16、20、24 h 進樣 20 μL，測定甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素含量，其對應的RSD分別為1.03%、1.25%、2.46和3.01%（n=6）。

2.10 加樣回收實驗［6］分別取甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素對照品適量，加入到已知含量的甘草粉末中，按2.2項下供試品液的制備方法制備樣品，測定4種黃酮類化合物的含量，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率

3 實驗結果

測定甘草總黃酮凍干粉末中四類黃酮類化合物的含量:乙醇提取液在292 nm處的圖譜如圖2所示。利用標準曲線得出樣品中甘草苷為27.72%，異甘草苷為10.87%，甘草素為0.17%，異甘草素為0.01%。樣品含量測定結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

4 討論

由含量測定結果可以看出，甘草原材料經純化富集后，甘草苷和異甘草苷的含量較高而苷元甘草素和異甘草素的含量相對較低，說明這種純化方法不適合于富集苷元。有文獻報導酸水解法可以通過水解苷的方式明顯提高甘草中苷元的含量［7］，但會減少苷的含量，對同時提高苷和苷元含量不利。

現有文獻在測定甘草黃酮類化合物3種或3種以上尤其在同時測定其中的苷和苷元時多采用雙波長檢測［4，6］，或者在梯度洗脫時間變換同時變換檢測波長［8］，操作較復雜，使重現性較差。本試驗采用在同一檢測波長下同時測出4種黃酮類化合物，大大簡化了操作過程，提高了精密度和靈敏度，重現性良好。

本試驗分別考察了甲醇-水，乙腈-水（0.5%醋酸），乙腈-水（0.04%甲酸）等體系進行洗脫，結果以乙腈-水（0.04%甲酸）體系進行小范圍梯度洗脫得到的色譜峰形較好，且相對穩定。實驗中將4個標準品等體積混合進樣得出4個標準品的混合圖譜，同時測定甘草中甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素的含量，簡化了甘草黃酮類化合物含量測定，為其指紋圖譜的研究奠定了基礎。

圖2 甘草乙醇提取液在292 nm處的圖譜

［1］張 波，劉會洲，官月平，等.烏拉爾甘草中黃酮類化學成分的研究進展［J］.中成藥，2006，28（9）:1362-1365.

［2］付玉杰，祖元剛，侯春蓮，等.超臨界CO2萃取異甘草素的提取工藝［J］.應用化學，2007，24（1）:67-70.

［3］楊玲娟，趙曉莉，狄留慶，等.HPLC法測定芍藥甘草湯總有效部位中4個活性成分的含量［J］.中華中醫藥學刊，2007，25（3）:522-523.

［4］趙曉莉，崔小兵，吳 皓，等.HPLC雙波長法測定復方甘草合劑中甘草苷、甘草素及異甘草素的含量［J］.中成藥，2002，24（3）:176-178.

［5］Liu Y，Yang J S.Determination of liquiritigenin，liquiritin，isoliquiritigenin and isoliquiritin in extract of traditional chinese medicine sijunzi decoction by High-performance liquid chromatography［J］.J Chin Pharm Sci，2005，14（4）:227-330.

［6］何三民，石森林.HPLC法測定甘草中甘草素、異甘草素、甘草苷的含量［J］.中草藥，2003，34（7）:618-619.

［7］付玉杰，祖元剛，劉曉娜，等.酸水解法提取甘草中異甘草素工藝研究［J］.中國藥學雜志，2007，42（11）:818-820.

［8］崔淑芬，張信青，許柏球，等.高效液相色譜法同時測定甘草中甘草酸和甘草苷的含量［J］.時珍國醫國藥，2006，17（3）:307-308.