高效液相色譜法測定心脈神膠囊中大黃素含量

曹 健，黃林清，王 芳，朱麗莎，張恩娟

（1.第三軍醫大學新橋醫院藥學部，重慶 400037； 2.重慶醫科大學藥學系，重慶 400016）

心脈神膠囊是我院研制的非標制劑，由何首烏、黃芪、赤芍等中藥組成，臨床應用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的治療，對急性心肌梗死恢復期、心絞痛的防治及缺血性心肌病等，療效較好。大黃素為何首烏的主要有效成分之一，具有涼血解毒、逐瘀通經的功效。筆者選用高效液相色譜（HPLC）法測定了心脈神膠囊中大黃素的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 600型高效液相色譜儀（美國Waters公司），紫外檢測器；ME 235 s型電子天平（德國Sartorius）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）；CSF-1A型超聲波發生器（上海超聲波儀器廠）；CS202A型電熱保溫干燥箱（重慶實驗設備廠）；RE-52A型旋轉蒸發儀（上海亞索生化儀器廠）。大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為0714-9903）；心脈神膠囊（第三軍醫大學新橋醫院自制，規格為 0.45 g/粒，批號分別為 070806，080325，080729）；陰性對照樣品（缺何首烏）為本院自制。甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS 柱（150 mm ×4.6 mm，10 μm）；流動相：甲醇 -0.02 mol/L 磷酸 （75 ∶25）；流速：1.2 mL/min；檢測波長：438 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取大黃素對照品5.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇振搖使溶解，定容至刻度，即得對照品溶液。精密稱取心脈神膠囊內容物5 g，加50 mL無水乙醇，在85℃下回流1 h，過濾，濾液于65℃旋轉蒸發儀上蒸干，加甲醇溶解乙醇提取物，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。精密稱取陰性對照樣品膠囊內容物5 g，按照供試品溶液制備方法制備缺何首烏的陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：將對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液3種溶液分別進樣10 μL，高效液相色譜圖見圖1。可見陰性對照品溶液對大黃素的含量測定無干擾。

標準曲線繪制：精密量取對照品溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測定。以峰面積（A）對質量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程 A=33 111 090.9 C+396.4，r=0.999 8（n=5）。結果表明，大黃素質量濃度在0.002 2～0.011 0 g/L范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗：精密量取對照品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，連續進樣10 μL，測定5次，記錄色譜圖，測定大黃素對照品峰峰面積。結果平均峰面積為216 563，RSD=1.25%（n=5），表明儀器精密度良好。

重現性試驗：取同一批供試品5份，按供試品溶液制備方法制備，進樣測定。結果大黃素平均峰面積為207 207.2，RSD=2.5%（n=5）。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0，5，24 h時進樣，記錄每次進樣的峰面積。結果大黃素平均峰面積分別為213 614，213 280，214 478，RSD=0.29%（n=3），表明供試品溶液在 24 h 內基本穩定。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的心脈神膠囊內容物2.0 g，共3份，按供試品溶液制備方法制備，分別加入一定量的大黃素對照品溶液（0.11 g/L）0.5，1.0，1.5 mL，平行操作 5 次，依法測定。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液。分別精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10 μL進樣，測定峰面積，計算大黃素的含量。結果批號為070806，080325，080729的3批樣品中，大黃素平均含量分別為 0.012 7，0.014 1，0.016 8 mg/粒（n=5）。

表1 加樣回收試驗結果

3 討論

有文獻報道，將大黃素的甲醇溶液置紫外-可見光分光光度計掃描，結果大黃素在438，290，253，220 nm波長處均有吸收峰[1-2]，試驗證實438 nm作為檢測波長時雜質干擾較少，故采用438 nm作為檢測波長。

該制劑中何首烏以水煎提取后投料，所含蒽醌類化合物可溶于甲醇、乙醇、氯仿等有機溶劑[3]。若采用氯仿作為溶劑提取大黃素，在本試驗條件下檢測不到大黃素的色譜峰，若用無水乙醇作溶劑則既可減少水溶性雜質的干擾，又可充分提取大黃素。故采用無水乙醇作為溶劑提取大黃素。

大黃素可以通過回流[4]和甲醇超聲的方法來提取[5]。筆者對所考察幾個批號的膠囊做了兩種提取方法的對比試驗，取相同量的膠囊內容物分別同時進行無水乙醇回流和甲醇超聲（250 mA），時間均為1 h，此后的操作方法相同。結果采用甲醇超聲提取的大黃素含量僅為無水乙醇回流提取的30%～60%。故采用無水乙醇回流提取心脈神膠囊中的大黃素。

本文中3個批次的膠囊中大黃素含量有較大差異。由文獻[6]可知，受產地、生長年限、采收季節等因素影響，大黃素含量差異較大，西南地區何首烏藥材中大黃素的含量為0.004% ～0.41%。根據心脈神膠囊中何首烏的用量并結合制備工藝的影響，擬訂心脈神膠囊中大黃素的最低限量為0.012 mg/粒。

[1]丁賢貴，劉麗娜，李勇軍，等.反相高效液相色譜法測定心腦聯通膠囊中大黃素的含量[J]. 貴陽醫學院學報，2005，30（3）：232-234.

[2]羅金樹，譚永恒.HPLC法測定芩黃喉癥膠囊中大黃素的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（3）：224-226.

[3]肖崇厚，楊松松，丁林生，等.中藥化學[M].上海：上海科學技術出版社，2004：205-206.

[4]瞿發林，談麗娜，趙 勇.復方夜靈膠囊中大黃素的含量測定[J].中國藥師，2006，9（12）：1 127-1 129.

[5]劉玉紅，王 妮.HPLC測定大敗毒膠囊中大黃素的含量[J].中醫藥學刊，2006，24（5）：936-938.

[6]張 韻，勞三申，唐青華.西南地區何首烏原藥材的質量分析[J].中成藥，1999，21（6）：317-319.