農(nóng)桿菌介導(dǎo)魚腥草遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素

董燕，張瑩，來慧麗，周聯(lián)，王培訓(xùn)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)免疫與分子生物學(xué)技術(shù)研究室，廣東 廣州 510405)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法已在多種藥用植物中實現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化，如百合、廣藿香、人參、美國洋參等，而以魚腥草為轉(zhuǎn)基因受體進行遺傳轉(zhuǎn)化的研究尚未見研究報道。轉(zhuǎn)基因受體材料的種類和生長狀態(tài)、農(nóng)桿菌感染能力、菌株質(zhì)粒組合、添加創(chuàng)傷反應(yīng)誘導(dǎo)物以及通過改變創(chuàng)傷方式、增強受體材料被感染能力等因素對轉(zhuǎn)化頻率影響較大，直接影響轉(zhuǎn)化結(jié)果。本研究對藥食兩用、極具開發(fā)潛力的魚腥草遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素進行比較分析，篩選適宜轉(zhuǎn)化條件，以提高轉(zhuǎn)化效率，為獲得穩(wěn)定表達外源基因的轉(zhuǎn)基因魚腥草奠定基礎(chǔ)。

魚腥草為三白草科植物蕺菜(Houttuynia cordata Thunb.)的全草，是多年生草本植物，具清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效，且其嫩葉、根莖可食用，是藥食兩用、極具開發(fā)潛力的資源之一［1］。由于魚腥草臨床應(yīng)用廣泛，加上新產(chǎn)品的不斷開發(fā)，市場需求量不斷增大，野生資源供不應(yīng)求，人工栽培發(fā)展迅速，已成為經(jīng)濟價值較高的經(jīng)濟作物，但品種退化、抗病力下降、病蟲害嚴重等問題隨之產(chǎn)生［2，3］。將基因工程技術(shù)應(yīng)用于魚腥草種質(zhì)資源優(yōu)化或作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白具有良好的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 植物材料 魚腥草(Houttuynia cordata Thunb.)無菌苗，培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基上，25℃ ～28℃，光照14h·d－1，光照度 2000 lx。

1.2 質(zhì)粒和菌株 質(zhì)粒pBI121和質(zhì)粒pCAMBIA1305.2均攜帶GUS(β－葡萄糖醛糖苷酶)報告基因和細菌選擇標記卡那霉素抗性基因，質(zhì)粒pBI121具有卡那霉素抗性植物選擇標記，pCAMBIA1305.2具有潮霉素抗性植物選擇標記;插入抗菌肽基因CN的重組質(zhì)粒pBI121－CN和pCAMBIA1305.2－CN為本實驗室構(gòu)建;經(jīng)轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌株和EHA105菌株獲得LBA4404/pBI121、LBA4404/pBI121－CN 和 EHA105/pCAMBIA1305.2、EHA105/pCAMBIA1305.2－CN。

1.3 主要試劑 植物激素－奈乙酸(NAA)、呋喃氨基嘌呤(KT)、6－芐基腺嘌呤(6－BA)，頭孢霉素(Cefotaxine)、利福平(Rifampicin)(廣州威佳生物技術(shù)公司);卡那霉素(Kanamycin)和羧芐青霉素(Carbenicillin)(美國Sigma公司);氯霉素(Chloramphenicol，MEBCHEM公司);潮霉素(hygromycin，Hyg，德國 Roche公司);乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS，美國 MEBCHEM);5－溴－4氯－3－吲哚－β－D葡萄糖苷酸酯(X－Gluc，美國Ameresco公司);植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，天根生化科技(北京)有限公司);Southern blot試劑盒“DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ”(Roche公司);DNA Ladder 100(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.4 培養(yǎng)基 植物組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為MS，用于無菌苗的培養(yǎng);在 MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度0.1mg·L－1NAA、2.0mg·L－16－BA、0.5mg·L－1KT，稱為MS－R培養(yǎng)基，用于外植體的離體再生;MS－R中添加不同濃度的乙酰丁香酮(AS)用于共培養(yǎng)，添加抗生素用于篩選培養(yǎng)。YEB培養(yǎng)基(含質(zhì)量濃度50mg·L－1利福平和 100mg·L－1卡那霉素)用于培養(yǎng)農(nóng)桿菌 LBA4404/pBI121;LB培養(yǎng)基(含氯霉素17mg·L－1和 100mg·L－1卡那霉素)用于培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1305.2。

1.5 主要儀器 PCR擴增儀(美國 ABI公司，2720型)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(英國UVP公司)。

1.6 農(nóng)桿菌的活化 挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種于3mL液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r·min－1，振蕩培養(yǎng) 16h 后，取1mL菌液，加入到30mL液體培養(yǎng)基(含100μmol·L－1乙酰丁香酮)中，振蕩培養(yǎng)至A600約為0.6，將培養(yǎng)物以5000r·min－1離心5min，收集菌體用MS液體培養(yǎng)基重懸至不同菌液濃度用于轉(zhuǎn)化。

1.7 外植體的轉(zhuǎn)化

取無菌苗的葉片，切下直徑為5mm的葉圓片為外植體，葉面朝上置于含植物激素的MS培養(yǎng)基上(NAA 0.1mg·L－1、6－BA 2.0mg·L－1、KT 0.5mg·L－1)，避光預(yù)培養(yǎng)1～7d，分別浸沒于菌液中侵染葉片10、15、20、25、30min，取出后置于無菌濾紙上吸去附著的菌液，置于培養(yǎng)基上，避光共培養(yǎng)2～7d，轉(zhuǎn)入含抗生素的篩選培養(yǎng)基，進行光照培養(yǎng)。

1.8 GUS活性的組織化學(xué)鑒定

GUS組織化學(xué)染色法檢測β－葡萄糖醛糖苷酶活性，參照《植物分子生物學(xué)實驗指南》(Maliga et al.，2000)。

1.9 目的基因的鑒定

以植物DNA提取試劑盒提取抗性植株總DNA，以目的基因CN的上、下游引物進行PCR鑒定。引物序列如下:上游引物5＇gcc aga tct cta gaa tga aat gga aag 3＇，下游引 物 5 ＇atg gtg acc gag ctc cta tta tct tcta 3 ＇。Southern blot采用Roche公司的“DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ”試劑盒，操作流程按使用說明書進行。

“吳耕要是知道我們過了六試，不知道會有多開心，既來之，則安之，我知道司徒一一的甲人有多可怕，但我偏不怕。”袁安微笑著說。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對魚腥草離體再生的影響

為確定適當濃度的卡那霉素或潮霉素用于篩選轉(zhuǎn)基因抗性植株，并確定用于抑制農(nóng)桿菌的頭孢霉素和羧芐青霉素對魚腥草生長活性無明顯影響的濃度范圍，以魚腥草葉片為外植體，接種于添加不同種類、濃度抗生素的MS－R培養(yǎng)基中，于4周統(tǒng)計分化出芽且芽生長狀態(tài)良好的外植體數(shù)，計算出芽率(表1)，結(jié)果表明，卡那霉素5mg·L－1時，10.7%的外植體有分化出芽，在10mg·L－1卡那霉素的作用下，無分化出芽，但8周時外植體活力尚好，因此篩選前期采用5mg·L－1濃度，8 周后采用 10mg·L－1濃度篩選 LBA4404/pBI121轉(zhuǎn)化的抗性植株。潮霉素 2.5mg·L－1時，8.2%的外植體分化出芽，但8周時芽仍弱小，生長很緩慢;5mg·L－1濃度時培養(yǎng)至4周無分化芽，且已有50%葉片萎黃失活，因此采用2.5mg·L－1潮霉素篩選EHA105/pCAMBIA1305.2轉(zhuǎn)化的抗性植株。

用于抑制和殺死農(nóng)桿菌的頭孢霉素對魚腥草離體再生有較明顯的影響，且在150mg·L－1～250mg·L－1濃度范圍所產(chǎn)生的影響無明顯差異，而羧芐青霉素在400mg·L－1時仍可獲得較高的再生頻率。

表1 不同抗生素濃度對外植體再生的影響

2.2 抑菌劑種類與濃度

通過抑菌圈實驗比較頭孢霉素和羧芐青霉素對農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105的抑菌作用(表2)，發(fā)現(xiàn)頭孢霉素的抑菌作用明顯優(yōu)于羧芐青霉素，在250mg·L－1濃度下抑菌作用明顯，且該濃度下魚腥草再生出芽率可達到20%以上，故選擇250mg·L－1的頭孢霉素抑制轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌。

表2 頭孢霉素與羧芐青毒素對農(nóng)桿菌的抑菌效果

2.3 菌液濃度與侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響

分別以A600為0.9、0.6、0.3的不同濃度農(nóng)桿菌菌液浸泡侵染魚腥草葉片 5、10、15、20min，其他條件為預(yù)培養(yǎng)2d、共培養(yǎng)2d、轉(zhuǎn)至含抗生素的MS－R培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，通過受侵染的魚腥草愈傷組織的生長分化情況確定農(nóng)桿菌侵染濃度和時間。當農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1305.2菌液A600=0.9時，魚腥草葉片在10d內(nèi)全部枯萎，A600=0.6時，20d內(nèi)全部枯萎，而當A600=0.3，侵染時間為15min時，受侵染葉片出現(xiàn)愈傷組織并分化出芽(表3)，在農(nóng)桿菌LBA4404/pBI121的轉(zhuǎn)化實驗中亦表現(xiàn)相同的趨勢，因此確定該濃度和時間有利于外植體的轉(zhuǎn)化。

表3 侵染時間對愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

2.4 預(yù)培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響

將魚腥草葉片在MS－R培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)，以 A600為0.3的活化菌液侵染15min，共培養(yǎng)2d后，對外植體進行GUS瞬時表達檢測，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化中，預(yù)培養(yǎng)4～5d的葉片GUS陽性率較高，繼續(xù)延長預(yù)培養(yǎng)時間至6～7d時，GUS陽性率有所下降，故選用預(yù)培養(yǎng)4d進行轉(zhuǎn)化;農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化中，預(yù)培養(yǎng)6 d的葉片GUS陽性率較高，并且轉(zhuǎn)化后再生出芽率也較高。

2.5 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化中，不同共培養(yǎng)時間的GUS檢測發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)3～6d的葉片GUS陽性率均較高，且共培養(yǎng)3d的葉片在后續(xù)培養(yǎng)中活力較好，故選用共培養(yǎng)3d進行轉(zhuǎn)化。在LBA4404轉(zhuǎn)化中，共培養(yǎng)5～7d的葉片GUS陽性率較高，7d達到最高，因此共培養(yǎng)時間確定為7d。

2.6 AS對轉(zhuǎn)化效率的影響

在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中分別加入 0、100、150、200μmol·L－1的乙酰丁香酮(AS)，對轉(zhuǎn)化體進行 GUS檢測發(fā)現(xiàn)，未添加AS的EHA105/pCAMBIA1305.2和LBA4404/pBI121轉(zhuǎn)化的GUS陽性率分別為25.0%和15.4%，添加 AS的轉(zhuǎn)化體陽性率明顯升高，在200μmol·L－1時最高，EHA105 達 78.6%，LBA4404達63.6%，且外植體上藍斑數(shù)量與面積最大。故選擇添加 AS 200μmol·L－1用于魚腥草的轉(zhuǎn)化。

2.7 溫度、菌體重懸及洗滌外植體的影響

為比較溫度對轉(zhuǎn)化的影響，分別在17℃、20℃、23℃、26℃、29℃不同溫度下進行農(nóng)桿菌浸泡侵染外植體，通過GUS檢測外植體陽性率的比較，發(fā)現(xiàn)EHA105轉(zhuǎn)化魚腥草在23℃、26℃時轉(zhuǎn)化陽性率較高;LBA4404的轉(zhuǎn)化中，20℃ ～26℃轉(zhuǎn)化的GUS陽性率差別不明顯，但都高于17℃，在篩選培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)26℃轉(zhuǎn)化的魚腥草外植體活力較好，故選擇在26℃進行轉(zhuǎn)化。并且在農(nóng)桿菌侵染葉片的操作中，將活化的農(nóng)桿菌離心，用MS液體培養(yǎng)基重懸，再進行侵染，轉(zhuǎn)化外植體的GUS陽性率均高于未重懸的菌液。

為減少農(nóng)桿菌對外植體活力的影響，在轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基前，將葉片進行洗滌，并比較不同洗滌方式對外植體活力及分化的影響，確定將外植體置于MS液體(含頭孢霉素250mg·L－1)中，40r·min－1振蕩10min，洗滌2次;再用無抗生素的MS液洗10min，以去除抗生素，然后置于篩選培養(yǎng)基表面。經(jīng)洗滌的魚腥草葉片在后續(xù)的篩選培養(yǎng)中的活力明顯優(yōu)于未洗滌過的葉片，抗性芽發(fā)生率明顯提高。

2.8 菌株/質(zhì)粒組合對轉(zhuǎn)化的影響

經(jīng)過對菌液密度、侵染時間、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間、添加乙酰丁香酮(AS)等轉(zhuǎn)化條件的篩選，確定了EHA105/pCAMBIA1305.2和LBA4404/pBI121轉(zhuǎn)化魚腥草的適宜條件(見表4)。對GUS瞬時表達的分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EHA105侵染的外植體中GUS陽性率高于LBA4404，說明 EHA105/pCAMBIA1305.2菌株/質(zhì)粒組合對魚腥草的侵染能力較強。

但在隨后的抗性篩選中，EHA105轉(zhuǎn)化的外植體抗性愈傷發(fā)芽率低于LBA4404，其原因可能在于一方面頭孢霉素對EHA105的抑菌效果不如LBA4404;另一方面GUS的瞬時表達可說明外源基因已轉(zhuǎn)入魚腥草細胞，但并不能確定是否整合進細胞染色體中，沒有整合到染色體上的外源DNA在細胞生長過程中丟失，造成抗性丟失;此外，整合到染色體上的外源基因受到整合位點、拷貝數(shù)等因素的影響可能出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象，導(dǎo)致抗性基因表達水平低或不表達，影響抗性芽的獲得。而魚腥草細胞對潮霉素、卡那霉素耐受性的差異等因素也會影響發(fā)芽率。因而綜合考慮上述因素，根據(jù)抗性芽百分率，結(jié)果顯示LBA4404/pBI121菌株/質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)化魚腥草優(yōu)于EHA105/pCAMBIA1305.2。

表4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的魚腥草遺傳轉(zhuǎn)化條件與植株再生

2.9 抗性植株的再生與鑒定 見圖1、2

圖1 基因組DNA中目的基因的鑒定

圖2 PCR產(chǎn)物的Southern blot結(jié)果

經(jīng)過對轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，受侵染葉片能較好產(chǎn)生愈傷組織并分化。轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基后約2周愈傷顆粒開始長出，6周開始分化出芽，8周統(tǒng)計抗性芽百分率(見表4)，并轉(zhuǎn)至MS基本培養(yǎng)基(含抗生素)進行生根培養(yǎng)。隨后的觀察發(fā)現(xiàn)大部分芽能保持綠色，但不能進一步生根和伸長生長，只有少數(shù)分化出的芽苗能保持生長。以穩(wěn)定生長的轉(zhuǎn)化植株總DNA進行目的基因的PCR，獲得與預(yù)期大小一致的PCR產(chǎn)物(圖1)，對PCR產(chǎn)物進行Southern雜交分析，在相應(yīng)位置出現(xiàn)雜交帶(圖2)。結(jié)果表明，目的基因已整合到魚腥草基因組中。

3 討論

根據(jù)具體植物材料和農(nóng)桿菌菌株摸索轉(zhuǎn)化條件、提高轉(zhuǎn)化頻率和轉(zhuǎn)化植株再生率是獲得轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵，因而需要對轉(zhuǎn)化的各個環(huán)節(jié)進行條件優(yōu)化。

植物受傷細胞分泌的一些酚類化合物可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的Vir區(qū)基因活化，進而介導(dǎo)T－DNA的轉(zhuǎn)移。目前廣泛使用的是乙酰丁香酮(AS)，但在某些植株的轉(zhuǎn)化上，如草莓等，乙酰丁香酮的使用無效甚至有害，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗菌肽A基因轉(zhuǎn)入沙田柚中發(fā)現(xiàn)酚類化合物對轉(zhuǎn)化的影響差別較大［5］。魚腥草的轉(zhuǎn)化中添加AS有明顯的促進作用，在200μmol·L－1時GUS陽性率最高，且外植體上藍斑數(shù)量與面積最大。

外植體的預(yù)培養(yǎng)時間是其生理狀態(tài)的重要影響因素，也是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的預(yù)培養(yǎng)時間多為2～3d，如佛手的遺傳轉(zhuǎn)化［6］，而不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)1周以上的也有報道。本實驗在EHA105轉(zhuǎn)化中預(yù)培養(yǎng)4d，LBA4404轉(zhuǎn)化中預(yù)培養(yǎng)7d的條件下GUS陽性率和再生出芽率均較高。

農(nóng)桿菌的屬性對轉(zhuǎn)化的成功有決定性的影響，不同的農(nóng)桿菌對受體組織的敏感性不同，在植物與農(nóng)桿菌之間存在著適應(yīng)性，因而不同的作物種類在基因轉(zhuǎn)化過程中存在著最合適或最為敏感的農(nóng)桿菌菌株［7］。超毒力菌株EHA105屬于農(nóng)桿堿型，侵染能力較強，農(nóng)桿菌LBA4404屬于章魚堿型。在水稻的研究中，發(fā)現(xiàn)EHA105對受體組織的敏感性高于普通型宿主LBA4404［8］。而在小麥幼胚愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化中，LBA4404/pBTAaB轉(zhuǎn)化的抗性愈傷頻率最高，其次是EHA105/p3301，AGL－1/p3301 的轉(zhuǎn)化頻率最低［9］。在大麥的遺傳轉(zhuǎn)化中，LBA4404/pYF133轉(zhuǎn)化效率高于LBA4404/pUGB7，也說明菌株質(zhì)粒組合影響轉(zhuǎn)化效率［10］。

魚腥草的轉(zhuǎn)化中，雖然經(jīng)超毒菌株EHA105侵染的外植體中 GUS表達陽性率高于 LBA4404，說明EHA105侵染能力較強，但外植體抗性愈傷發(fā)芽率及轉(zhuǎn)基因植株獲得率均低于LBA4404。原因可能在于EHA105/pCAMBIA1305.2與 LBA4404/pBI121菌株/質(zhì)粒組合的基因型不同，存在對受體材料造成的損傷程度不同、抗性篩選中抗生素的種類不同、外源基因的整合情況等因素的差異，從而影響轉(zhuǎn)化結(jié)果。研究表明，LBA4404/pBI121菌株/質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)化魚腥草優(yōu)于EHA105/pCAMBIA1305.2。

本研究通過對魚腥草遺傳轉(zhuǎn)化過程中幾個主要影響因素的比較，確定在菌液濃度A600為0.3、26℃時浸泡15min條件下，對預(yù)培養(yǎng)的外植體進行侵染，經(jīng)適當?shù)墓才囵B(yǎng)，并添加 AS 200μmol·L－1，有利于轉(zhuǎn)化，經(jīng)適當?shù)南礈烊コr(nóng)桿菌后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為培育魚腥草基因工程新品種、開展種質(zhì)資源的優(yōu)化研究奠定了基礎(chǔ)。

致謝:本研究得到了賀紅、曹柳英、梁瑞燕、林小樺、張桂芳等的協(xié)助!

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