昆明市3種草坪草根際鐮孢菌的分離鑒定

張成霞

(西南林業大學園林學院,云南昆明 650224)

鐮孢菌是真菌的一個重要類群,分布廣泛,是最重要的病原菌之一,引起植物根腐、根頸腐爛、立枯、萎蔫等多種病害[1-3];侵染寄主植物引起的萎蔫病是生產上最難防治的重要病害之一[4]。近10年,對鐮孢菌侵染植物寄主并造成植物萎蔫的致病機理、病原菌在植物體內的擴展動態規律以及利用分子生物學技術研究鐮孢菌的遺傳變異等,國內外作了大量的研究報道[5]。自1999年世界園藝博覽會在昆明召開以來,昆明市草坪種植面積大幅增加,草坪病害也隨之不斷增加。如今,鐮孢菌引起的病害是昆明地區草坪草的主要病原菌之一[6]。然而,鐮孢菌的分類學是鐮孢菌生物學的各個領域研究的基礎,也是當今世界上的一大難題,從1809年Link建立鐮孢菌屬以來,大約有50多種不同種類的鐮孢菌株得到定名[7];迄今為止,用于鐮孢菌屬的種類劃分已經有10種不同的分類系統[8],以往的鐮孢菌分類中,負侖委貝(Wollenweber)系統和施奈德(Snyder)系統應用可以說是代表了種的觀念上的兩個對立面,前者采取小種化的作法,后者抱大種化的立場,兩種極端,各有弊病;Booth以 Wollenweber系統為基礎,吸收了Snyder系統的合理部分,推出了44種分類系統,受到了人們的普遍歡迎,也得到我國鐮刀菌工作者的充分肯定[9,10]。采用Booth的分類系統,對云南省昆明市主要種植的3種草坪草根際土壤鐮孢菌進行分離培養,并對其進行鑒定,以期能為該地區草坪草病害防治奠定一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 標本的采集

2009年7月16日,分別采集昆明市高羊茅、多年生黑麥草和草地早熟禾根際樣品,裝入無菌封口聚乙烯袋,帶回室內即分離植物根際土壤真菌。

1.2 方法

1.2.1 鐮孢菌的分離及純化 選用馬鈴薯蔗糖培養基(PSA)[11],采用洗根法分離根際真菌[12],對分離所得菌株進行篩選,并采用單孢分離[13,14],將單孢菌株在柏斯條件下進行培養[9,10]。

1.2.2 培養性狀的測定及形態鑒定 培養5 d后,測定菌落直徑,并對鐮孢菌的小型分生孢子形狀,大小,著生方式;產孢細胞的類型,大小;大型分生孢子形狀,數量,著生方式,大小,分隔;子實體類型,分生孢子座,粘孢團;厚垣孢子等進行觀察和顯微照相。

2 結果與分析

2.1 高羊茅根際鐮孢菌形態

2.1.1 黃色鐮孢 5 d后菌落直徑48 mm,菌落白色,微顯黃褐色,氣生菌絲較繁茂,絮狀,稍有結團現象,菌背淡黃褐色,中部有褐色小點,菌絲無色。產孢梗長短不等,上部叢生成。大型分生孢子紡錘型,鐮刀型,彎曲,端部尖細,一般 2～5隔,大小 14.8～32.1×2.42～4.84(23.6×4.43)μ m;小型分生孢子橢圓形,卵形,瓜子形,大小 8.8～19.8×2.2～4.4(14.3×3.3)μ m(圖 1)

2.1.2 茄病鐮孢[Fusariun solani(Mart)Sacc]5 d后菌落直徑35 mm,菌落白色,中等繁茂,生長均勻,較稀疏,菌背略呈白色,后期底部由內到外變桃紅色。產孢梗單瓶梗,多分枝。大型分生孢子極少,小型分生孢子特別多,無色,棒狀,兩端圓,大小差異大,大小4.6～16.6×1.56～4.8(6.3×3.18)μ m 。

2.2 多年生黑麥草根際鐮孢菌形態

2.2.1 茄病鐮孢[Fusariun solani(Sacc)Booth]5 d后菌落直徑31 mm,菌落白色,中等繁茂,菌落上層細密,生長均勻,中部厚邊緣薄,中部有一灰蘭圈環,內部有灰蘭色細點,菌背環內有放射狀蘭綠色小點。產孢梗單瓶梗,在菌絲頂端形成,長短不等;大型分生孢子棒狀,直或彎曲,兩端稍圓,2～7隔(多3～4隔),大小18.82～37.63×4.12～5.88(30.10×4.89)μ m;小型分生孢子橢圓形,腎形,1～2隔,大小7.06～19.99×2.35～4.70(11.66×3.57)μ m(圖1～3)。

2.2.2 尖孢鐮孢 5 d后菌落直徑44 mm,菌落白色,生長快,棉絮狀,繁茂,有少量團絮;菌底桃紅—紫紅色,有些內部有黃色斑塊或黃色放射狀條紋。產孢梗單瓶梗;大型分生孢子美麗型,3～4隔,大小 9.9～22.2×2.2～4.4 μ m小型分生孢子長橢圓形,香蕉形,短桿狀,0～1隔,大小4.70～16.46×2.53～3.53 μ m 。

2.3 草地早熟禾根際鐮孢菌形態

2.3.1 茄病鐮孢[Fusarium solani(Mart)Sacc]5 d后菌落直徑25 mm,菌落白色至淡灰綠色,平坦,繁茂,細絨狀,菌背略呈現淡藍綠色放射線及輪紋,菌絲無色,上生許多孢子球。大型分生孢子較少,多數美麗型,少數為馬特型,多1～2隔,大小 16.46～25.87×2.94～4.70 μ m;小型分生孢子較多,長橢圓形,短桿狀,大小 8.5～16 ×2.7～3.5 μ m;產孢梗直 ,很長 ,二分杈,頂生孢子及孢子球。

2.3.2 雪腐鐮孢 5 d后菌落直徑46 mm,菌落土黃色,稀薄,平鋪,細絨狀,菌背土黃色,菌絲無色。大型分生孢子彎月形,兩端尖,大多有一格,少數無格,大小11.47～14.11×2.39～2.46 μ m;小型分生孢子很少,橢圓形,大小 3.57～8.63×1.96～2.55 μ m;孢子球很多,未見產孢梗。(圖1～6)。

圖1 黃色鐮孢Fig.1 Fusariumeulmorum

圖2 茄病鐮孢Fig.2 Fusarium solani

圖3 茄病鐮孢Fig.3 Fusarium solani

圖4 尖孢鐮孢Fig.4 Fusariumoxysporum

圖5 茄病鐮孢Fig.5 Fusarium solani

圖6 雪腐鐮孢Fig.6 Fusarium nivale

3 討論

在傳統的真菌分類學研究中,孢子的性狀一直都是比較和研究的重點,鐮孢菌也不例外,其分生孢子的長度和寬度被認作是分種的主要依據。鐮孢菌是一類較難鑒定的真菌,柏斯分類鑒定系統是目前世界較普遍使用的方法之一。他對分生孢子梗的性狀,鑒定培養基、培養方法及條件標準化的做法都較穩定。根據柏斯鑒定系統,在3種草地中共鑒定出4種鐮孢菌,他們分別是茄病鐮孢、黃色鐮孢、尖鐮孢和雪腐鐮孢,其中茄病鐮孢在高羊茅、多年生黑麥草、草地早熟禾草根際的孢子大小及單孢分離性狀等有差異,他們可能為該種的不同專化型,有待繼續研究鑒定;另外,不同的菌株,即使是在相同的條件下,他們之間也還會存在一定的差異。張祖新等研究發現,草坪草鐮孢菌腐爛病的病原至少有 6種:F.acuminatum、F.roseum、F.tricinctum 、F.graminearuin、F.culmorum 和 F.rookwellenseum等[17]。許多研究表明,土壤中鐮孢菌的多樣性水平非常高,而且土壤中鐮孢菌多樣性水平對其中致病菌的種群動態及寄主的抗性表現也會產生一定的影響[18]。近年來,rDNA ITS序列分析已用于鐮孢菌的分子鑒定,在形態鑒定的基礎上用分子系統學澄清了該屬許多種間、種內系統發育關系、有性型與無性型的聯系,而且使得分類系統學本身得也到了進一步的發展[19-21],因此,對于鐮孢菌的鑒定應該同時采取多項分類法。本研究通過形態學觀察,從昆明市各草坪根際分離鐮孢菌菌株鑒定出4個種,對于昆明市植物檢疫、植物鐮孢菌病害防治和鐮孢菌資源的利用,具有一定的參考價值。

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