高效液相色譜法測定人血漿中鹽酸偽麻黃堿質量濃度

李 麗，高運軍，吳 堯

(江蘇省南京市中醫院，江蘇 南京 210001)

鹽酸偽麻黃堿是麻黃堿的一種差向異構體，常用于治療呼吸道黏膜充血、水腫。有關偽麻黃堿血藥濃度的測定方法報道較多，如高階導數光譜法[1]、電化學法[2]、串聯質譜法[3]、雙波長薄層掃描法[4]及高效毛細管電泳分離電導法[5]等，使用最多是高效液相色譜(HPLC)法。筆者對測定人血漿中鹽酸偽麻黃堿的HPLC法進行了研究，報道如下。

1 儀器與試藥

LC－10AVP型高效液相色譜儀，包括LC－10AD型泵、SPD－

10AVP型檢測器、LC－solutions色譜系統(日本Shimadzu公司);FA1004型分析天平(上海天平儀器廠);MDF－382E超低溫冰箱

(日本三洋公司)。鹽酸偽麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為171237－200304);鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為713－9404);空白血漿(南京市中醫院藥理室，－20℃保存，有效期至2010年10月23日);甲醇(批號為20050308)、乙腈(批號為20050519)均為HPLC級，其他試劑均為分析純，實驗用水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:ODS 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:60 mmoL/L十二烷基硫酸鈉、60 mol/L磷酸二氫鈉水溶液(磷酸調pH=3.5)－乙腈(40∶60);流速:1 mL/min;檢測波長:213 nm;進樣量:40 μL;柱溫:30℃。

2.2 溶液制備

精密稱取十二烷基硫酸鈉(SDS)17.511 1 g，置錐形瓶中，加水500 mL，超聲溶解，再加入磷酸二氫鈉9.362 9 g，混勻，加水至1 000 mL，超聲溶解，再加三乙胺3 mL，混勻，用磷酸調pH=3.57(加磷酸約 1.5 mL)，經 0.45 μm 尼龍膜過濾，備用，即制得流動相。精密稱取鹽酸小檗堿對照品0.016 1 g，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得質量濃度為322 μg/mL的鹽酸小檗堿內標貯備液;精密量取內標貯備液5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇配成32.2 μg/mL的鹽酸小檗堿內標溶液。精密稱取鹽酸偽麻黃堿對照品7.9 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度為790 μg/mL的鹽酸偽麻黃堿貯備液;精密量取該貯備液1 mL，置5 mL量瓶中，用甲醇配成質量濃度為158 μg/mL的鹽酸偽麻黃堿標準品溶液。

2.3 樣品處理

取1 mL血漿樣品，精密加入30 μL鹽酸偽麻黃堿標準品溶液(158 μg/mL)，混合均勻，從中吸取 0.5 mL 混合液，置另一裝有0.5 mL血漿樣品的試管中，同樣方法操作5次，得到7份質量濃度逐級減半的鹽酸偽麻黃堿標準品血漿混合液，每份中加入內標溶液(鹽酸小檗堿 32.2 mg/mL)20 μL，混合堿液 0.5 mL，渦旋 2 min，加乙醚4 mL，渦旋2 min，吸取上清液另放;原試管中再加乙醚4 mL，渦旋2 min，吸取上清液，合并兩上清液;逐份加入0.1 mol/L H2SO4100 μL，渦旋 2 min，離心 4 min，棄去乙醚，取 40 μL 進樣。

2.4 方法學考察

標準曲線繪制及最低檢測限確定:于空白血漿中加入不同質量濃度的鹽酸偽麻黃堿標準品溶液適量，藥物質量濃度分別為0.0740625，0.148125，0.29625，0.5925，1.185，2.37，4.74 μg/mL，按前述方法提取、測定。在上述色譜條件下，鹽酸偽麻黃堿、內標的峰形對稱，與內源性雜質分離良好;鹽酸偽麻黃堿保留時間為5.7 min，內標保留時間為9.9 min。以鹽酸偽麻黃堿與內標峰面積比值為縱坐標(Y)、進樣質量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，得標準曲線方程為 Y=0.689 9 X+0.051 9，r=0.999 7(n=7)。結果表明鹽酸偽麻黃堿血漿樣品進樣質量濃度在70～4 000 μg/L范圍內與峰面積比值線性關系良好。人空白血漿、血漿樣品色譜圖見圖1。為了研究在本色譜系統下鹽酸偽麻黃堿的最低檢測濃度，按上述方法重新配制血漿樣品，濃度分別為 0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025 μg/mL，結果線性關系良好，故在本試驗條件下鹽酸偽麻黃堿的最低檢測質量濃度為0.012 5 μg/mL。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗:按回收率項下方法配制鹽酸偽麻黃堿血漿，提取后測定。以1 d內5次測定的鹽酸偽麻黃堿濃度計算日內精密度。另在1周內取上述鹽酸偽麻黃堿血漿每日各測定1次，計算日間精密度。結果低、中、高血漿日內 RSD分別為6.366%，5.595 1%，4.730 5%(n=5)，日間 RSD 分別 為 18.667 7% ，11.704 1% ，7.508 8%(n=7)。

提取回收率試驗:與空白血漿中加入適量鹽酸偽麻黃堿標準溶液，按樣品處理項下配制后取 2.37，0.592 5，0.148 1 μg/mL 3種質量濃度的血漿，按前述方法提取、測定。以1 d內5次測得的鹽酸偽麻黃堿濃度計算方法計算提取率，并以其峰面積與相應濃度未經提取的鹽酸偽麻黃堿溶液直接進樣，所得峰面積的比值計算提取率。結果見表1。

表1 鹽酸偽麻黃堿回收率測定結果(n=5)

穩定性試驗:考察低、中、高質量濃度血漿樣品在室溫、反復凍融和長期冷凍的條件下放置一定時間的穩定性。結果其性質能保持穩定，表明生物樣品測定可在30 d內進行。

3 討論

本試驗為Ⅰ期臨床試驗樣品測試方法學考察的質量控制部分。文獻所報道測定偽麻黃堿血藥濃度的HPLC法，用非那西丁作為內標物[6]，但試驗中發現，其出峰時間及提取率均不穩定，時常干擾樣品出峰等。后經摸索改用鹽酸小檗堿作為內標物，結果提取率高，且具有與藥物分離良好、對藥物無干擾、出峰時間早、峰形好等優點，試驗誤差也較非那西丁小，較其他內標定物也更準確。在試劑的選擇上，試驗初期曾使用乙醚－正己烷(1∶1)、正己烷－二氫甲烷－異丙醇(100∶50∶5)作為提取溶劑，但效果不理想，后改用100%乙醚分2次提取，提取率較高，均在60%以上，且含量穩定。鹽酸偽麻黃堿血漿蛋白結合率高，分子小，血樣處理較煩瑣。本試驗在流動相的選擇配比、血漿的處理上也做了一些改進。

本試驗建立了準確、靈敏的測定人血漿中鹽酸偽麻黃堿的方法，適用于鹽酸偽麻黃堿的藥代動力學研究及治療藥物濃度檢測。

[1]樓永明.高階導數光譜在藥物分析中的應用[J].福建分析測試，2003，12(2):1 743 － 1 745.

[2]丁祥歡，楚清脆，葉建農.感冒藥中鹽酸偽麻黃堿和撲熱息痛含量的毛細管電泳－電化學法測定[J].分析測試學報，2002，21(3):37－39.

[3]楊漢煜，陳笑艷，徐海燕.液相色譜－串聯質譜法測定人血漿中的偽麻黃堿濃度[J].沈陽藥科大學學報，2001，18(2):116－119.

[4]溫愛平，楊樹平，李紅英，等.雙波長薄層掃描法測定異麻匹林片中咖啡因和鹽酸偽麻黃堿含量[J].中國醫院藥學雜志，2000，20(5):262－264.

[5]鄭一寧，謝天堯，莫金垣，等.高效毛細管電泳分離電導檢測麻黃堿和偽麻黃堿[J].高等學校化學學報，2002，23(2):199－202.

[6]林觀樣，王志強，張春紅，等.高效液相色譜法測定人血中偽麻黃堿的含量[J].中國醫院藥學雜志，2005，25(9):824 －826.