不同產地山茱萸中熊果酸與齊墩果酸含量研究

金德莊，張 聰

(1.上海市食品藥品監督管理局認證審評中心，上海 200021;2.上海市中藥研究所，上海 200002)

山茱萸具有補益肝腎、收斂固澀的功效，主要含有有機酸、環烯醚萜類、皂苷、多糖等。文獻[1]采用高效液相色譜(HPLC)法，以齊墩果酸或熊果酸為指標分析山茱萸的質量。對山茱萸進行定量分析，大多是針對熊果酸，而對齊墩果酸和熊果酸同時進行含量測定的報道則極少。《中國藥典(一部)》采用薄層掃描法對六味地黃丸中山茱萸的有效成分熊果酸進行了定量分析，但操作煩瑣，顯色誤差大，重現性差。本試驗采用反相HPLC法，通過優化色譜條件來實現熊果酸與齊墩果酸的同時測定，報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 510型 HPLC Pump，Waters 996 PDA檢測器(美國 Waters公司);Millennium 32軟件色譜工作站;SY3200型超聲波(上海聲源超聲波儀器設備有限公司)。甲醇、乙腈(美國Merks公司);齊墩果酸對照品(批號為709－8903，中國藥品生物制品檢定所);熊果酸對照品(批號為77－52－1，MP Biomedicals Znc);其余試劑均為分析純(中國醫藥集團上海化學試劑有限公司);水為蒸餾水。山茱萸樣品見表1，均經上海市藥材公司王依群副主任藥師鑒定;除河南南陽產的藥材(1)是2002年采收，其余皆采收于2003年。

表1 不同產地的山茱萸樣品表

2 方法與結果

2.1 色譜條件優化

流動相選擇:山茱萸的主要成分包括非極性成分齊墩果酸與熊果酸，兩者都屬于大分子的有機酸，結構相似，極性相近，選擇合適的流動相分開這兩個成分的色譜峰，使分離度(Rs＞1.5)達到一定要求是本次試驗的難點之一，故流動相的選擇是關鍵。經多次試驗，最終確定流動相為乙腈－0.1%磷酸－甲醇(40∶10∶30)。

流動相流速選擇:考察了流動相不同流速(0.6，0.8，1.0mL/min)對分離組分的影響。結果流速對樣品的分離效果無影響，但可影響組分出峰時間的快慢。其中流速為0.6 mL/min時保留時間過長，流速為1.0 mL/min時保留時間較好，但流速大可引起色譜儀的柱壓過高，故選用0.8 mL/min為流動相流速。

檢測波長選擇:精密稱取山茱萸藥材粗粉，用無水乙醇超聲30 min，揮干、水溶出，用氯仿萃取，氯仿液揮干，用甲醇定容至20 mL。按擬訂的色譜條件測定，波長范圍在200～400 nm[2]。比較

了多波長下的色譜圖，最后選擇210.2 nm為檢測波長，此時色譜圖出峰數多、峰面積大，可提供的信息多，靈敏度高。

2.2 樣品處理方法優化

提取方法選擇:精密稱取樣品1 g，置圓底燒瓶中，加入40 mL無水乙醇，水浴60℃，回流提取2 h，過濾后，濾液置50 mL量瓶中，定容至50 mL，結果見圖1。精密稱取山茱萸藥材粗粉5 g，加無水乙醇30 mL，超聲提取30 min，提取液揮干，水溶出，用氯仿萃取3次，揮干氯仿，甲醇定容10 mL。結果見圖2。綜合考察，選擇無水乙醇超聲提取為樣品提取方法。

圖1 乙醇回流提取色譜圖

圖2 乙醇超聲提取色譜圖

提取溶劑選擇:精密稱取樣品粗粉(20目)，分別采用95%乙醇、無水乙醇、加熱回流及超聲提取，用氯仿、乙醚索氏提取。通過對上述幾種溶劑的提取效果進行分析，結果采用無水乙醇提取的樣品雖然極性成分與非極性成分的比例仍相差較大，但可見提取得到的齊墩果酸和熊果酸成分峰。在此基礎上，對無水乙醇超聲提取液進行氯仿萃取，可去除部分極性成分。結果經過氯仿萃取的樣品中齊墩果酸和熊果酸的相對含量明顯提高，可以進行含量測定。

萃取次數考察:精密稱取山茱萸粗粉5 g，加無水乙醇50 mL，超聲提取30 min，提取液揮干，加50 mL水溶解，加50 mL氯仿萃取2，3，4次，揮干氯仿，甲醇定容20 mL，測定齊墩果酸與熊果酸的含量。結果表明，采用3次萃取即可使待測成分完全轉移，故確定的萃取方法為加氯仿萃取3次、每次50 mL。

超聲提取條件選擇:從無水乙醇對山茱萸藥材的提取方法考察來看，采用熱回流和超聲提取效率相同，且超聲提取省時省力，故采用超聲提取。超聲提取過程的主要影響因素包括溶劑加入量、超聲時間及超聲提取次數。正交試驗結果表明，超聲提取最佳條件是10倍量的無水乙醇、提取2次、每次30 min。

2.3 色譜峰定位與純度鑒定

精密稱取華宇產山茱萸藥材粗粉5 g，加無水乙醇50 mL，超聲提取2次，每次30 min，提取液揮干，加水適量溶解，等體積氯仿萃取3次，氯仿液揮干，甲醇定容20 mL，進樣10 μL，測定。在利用色譜法定性時，關鍵是需要確認所分離出來的色譜峰是純組分，還是包含了其他化合物(不純組分)，這僅從UV檢測器的色譜儀所提供的色譜圖來作判斷是不夠的。而PDA檢測器的色譜儀就能判斷色譜峰的純度，它從2個方面入手，一是分析待測成分與其標準對照品的紫外光譜圖是否一致。二是純度角與純度閥值的比較。取2.2項萃取次數考察試驗中樣品，進樣測定，記錄色譜峰純度角及純度閾值。結果見表2。可見，待測峰純度符合要求，可以進行含量測定。

表2 待測成分峰純度鑒定

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱:YMC －PACK ODS－A 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.1%磷酸 －甲醇(40 ∶10 ∶30);檢測波長:210.2 nm;流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:25 ℃。

2.4.2 方法學考察

標準曲線制備:分別精密稱取齊墩果酸對照品15.2 mg或熊果酸對照品32.8 mg，以甲醇定容至10 mL，配制質量濃度分別為1.52 mg/mL 和 3.28 mg/mL 的對照品溶液，分別精密吸取 0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 mL，定容至 10 mL，進樣 10 μL，測定峰面積，以峰面積對進樣量進行線性回歸。得回歸方程齊墩果酸 Y=－9 318.585+5 942 790 X(r=0.999 9)，熊果酸 Y= －28 338.061+4 698 400 X(r=0.999 5)。結果表明，齊墩果酸與熊果酸進樣量分別在0.38 ～3.04 μg和0.82 ～6.56 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:分別精密吸取齊墩果酸與熊果酸對照品溶液，連續進樣5次。結果齊墩果酸和熊果酸峰面積的 RSD分別為1.21%和 2.22%(n=5)。

穩定性試驗:精密吸取同一供試品溶液，每間隔30 min進樣。結果顯示供試品溶液在2.5 h內穩定。

重現性試驗:精密稱取山茱萸粗粉5份(每份5 g)，照樣品處理方法處理后，進樣測定。結果齊墩果酸和熊果酸含量的 RSD分別為 2.22%和 1.99%(n=5)。

加樣回收試驗:分別精密稱取已知含量(齊墩果酸含量0.399 mg/g，熊果酸含量1.42 mg/g)的山茱萸粗粉6份，每份約2.5 g，平均分成3組，依次加入一定量的齊墩果酸、熊果酸對照品，按樣品處理方法處理，進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表3。

表3 齊墩果酸與熊果酸加樣回收試驗結果(n=6)

2.4.3 樣品含量測定

取不同產地的山茱萸，60℃下干燥至恒重，粉碎過20目篩，分別稱取5 g，按樣品處理方法處理，每個樣品平行制備3份，測定齊墩果酸、熊果酸含量，取平均值，結果見表4。

表4 不同產地山茱萸中齊墩果酸、熊果酸含量測定結果(n=3)

3 討論

山茱萸是各成藥方中的臣藥，主要含有齊墩果酸、熊果酸、蘋果酸、沒食子酸等[3]。其中熊果酸能明顯降低血糖、尿糖[4－5]，齊墩果酸有較強的抑菌、強心、利尿和保肝作用[6]，這兩個成分是山茱萸的主要指標成分。2000年版《中國藥典(一部)》山茱萸項下對熊果酸的含量測定采用薄層掃描法[7]，但由于熊果酸和齊墩果酸均屬于三萜酸，在化學結構上又是異構體，且兩者極性幾乎無區別，在薄層板上應用藥典中的條件無法分離開。目前文獻報道中，多數未將齊墩果酸與熊果酸分離，測得量實際為二者之和[8－9]。且這兩種成分在天然植物中似乎又是共存的[10]。本試驗采用反相高效液相色譜法，使兩者成分分離是試驗難點。流動相的選擇是關鍵，采用乙腈－0.1%磷酸－甲醇(40∶10∶30)作為流動相，在反相柱上，甲醇比例增減對兩者分離與保留均有較大影響，增加適量的磷酸，使它產生弱酸性環境，既有利于兩種三萜酸分離，又改善了峰形。

本試驗首次采集了來自不同產地的山茱萸樣品，且同時測定了樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量，這為山茱萸在成藥制劑中藥材的選擇提供了一個可靠、科學的依據。本試驗還首次利用PDA檢測器對所定量的4個組分色譜峰進行識別和純度分析，通過樣品中色譜峰和對照品紫外光譜圖對照和純度角證明，所測成分純度很高，定量準確，從而也證明了文中所優化的色譜條件是可行的。

[1]王曉紅.山茱萸幾種不同炮制品的熊果酸含量測定[J].中成藥，2000，22(7):480.

[2]段天璇，王靜竹，馮 鵬，等.山茱萸炮制前后沒食子酸溶出及煎出量比較[J].中國中藥雜志，1999，24(4):213.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，1990:19.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，1995:21.

[5]趙武述，張玉琴，李 潔，等.山茱萸成分的免疫活性研究[J].中草藥，1990，21(3):17.

[6]王 鵬，張忠義，吳 忠.熊果酸在藥用植物中的分布及藥理作用[J].中藥材，2000，23(11):717.

[7]劉 偉，李興奇.山茱萸中熊果酸及齊墩果酸的成分分析[J].河南中醫藥學刊，2000，15(5):15.

[8]李克明，楊小江，俞敏倩，等.薄層掃描法測定山茱萸中馬錢素的含量[J].中國中藥雜志，1994，19(12):738.

[9]顧世海，謝 忱，張 丹，等.HPLC法直接測定山茱萸中馬錢素的含量[J].中國中藥雜志，1996，21(7):429.

[10]張蘭桐，劉偉娜，王春英，等.HPLC法測定山茱萸注射液中馬錢素和莫諾苷的含量[J].天然產物研究與開發，1999，11(4):49.