2株胞內分枝桿菌臨床分離株的鑒定*

潘愛珍,張媛媛,王 心,趙秀芹,萬康林

由于非結核分枝桿菌(Non-tuberculosis Mycobacterium,NTM)肺病與結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis)引起的肺結核病的臨床表現極為相似,容易造成誤診誤治,而且非結核分枝桿菌病的發病呈逐年上升趨勢〔1〕。因此分枝桿菌的快速準確菌種鑒定對結核病的診斷和鑒別診斷及有效化療都有極其重要的意義。分子生物學技術鑒定菌種的方法雖有多種〔2〕,但如何聯合應用多種分類鑒定方法,克服每項技術的局限性,進而形成標準化體系是未來快速鑒定菌種的趨勢。我們在進行結核分枝桿菌臨床分離株的oxyR-ahpC間隔耐藥區的PCR檢測的過程中,發現用PNB,TCH鑒別培養基鑒定為結核分枝桿菌的兩株分枝桿菌臨床分離株的PCR擴增產物的分子量明顯大于結核分枝桿菌,而與胞內分枝桿菌相同,通過聯合應用多種分子生物學技術和生物信息學技術對這兩株菌株進行定種鑒定,最終確定為胞內分枝桿菌。并為探索新菌種鑒定的特異位點和菌種鑒定技術體系提供初步基礎。

1 材料與方法

1.1 6株待鑒定分枝桿菌臨床分離株 12個省市的285株(北京13株、福建106株、廣西8株、西藏49株、四川 39株、河南19株、湖南 20株、吉林 7株、甘肅17株、新疆4株、陜西1株、浙江2株)臨床分離菌株經PNB、TCH鑒別培養基初步鑒定為結核分枝桿菌。從這285株臨床分離菌株選取6株,其中包括oxyR-ahpC基因間隔區PCR擴增產物分子量異常的2株和隨機選取PCR擴增產物分子量正常的4株。

由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病研究室傳代培養、保藏。

1.2 標準參考菌株 分枝桿菌標準株,包括結核分枝桿菌標準株(H37Rv)、鳥分枝桿菌(95001),胞內分枝桿菌(95002),由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病研究室傳代培養、保藏。

1.3 培養基 常規羅氏培養基和PNB、TCH鑒別培養基由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病研究室按標準配置方法制備。

1.4 分枝桿菌標準株和臨床株DNA CTAB法提取〔3〕,生理鹽水收集結核分枝桿菌新鮮培養物50-100mg(濕重),用溶菌酶,10%SDS/蛋白酶K 混合液及CTAB破除細胞壁,去除蛋白,脂類等物質,然后用氯仿萃取,冰乙醇洗滌DNA沉淀,最后用TE溶解DNA沉淀,-20℃保存。

1.5 oxyR-ahpC間隔區PCR擴增、測序分析 引物為oxyR-ahpC1:5'-GCT TGATGTCCGAGAGCATCG-3',oxyR-ahpC2:5'-GGTCGCGTAGGCAGTGCCCC-3'),PCR反應體系為:引物各1.0μL,PCR-mix 20μL,DNA 模板2μL,純水 16μL。PCR 條件:預變性 94℃10min,變性 94℃1min,退火 60℃1min,延伸72℃1min,循環次數 30次,最后充分延伸72℃10min。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳25min,EB染色20min后,紫外燈下觀察結果。引物由賽百盛合成,PCR-mix購自天根公司,PCR擴增產物均由華大基因公司測序。測序結果用DNASTAR軟件比對,并在網站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行同源性比較。

1.6 多位點PCR擴增與電泳 選擇在結核分枝桿菌復合體菌種中存在不同分布的7個位點〔4〕作為擴增的目的條帶,PCR反應體系和反應條件同上,其中退火溫度為60℃,擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳25min,EB染色,紫外燈下觀察結果。

1.7 PCR-限制性內切酶酶切片段多態性分析(PCR-RFLP) PCR 引物為 hsp65F 和 hsp65R〔5〕反應體系和反應條件同上,其中退火溫度為60℃。擴增產物用HaeIII和BstpI兩種內切酶去酶切,體系為 HaeIII或 BstpI1μL,PCR 產物 15μL,10×H buffer或 10 ×B buffer 2μL,純水 2μL。分別在37℃和60℃孵育2 h。酶切產物選用4%Metaphor agrose瓊脂糖,100V 120min,EB染色,紫外燈下觀察結果。根據條帶泳動的位置和數量,確定不同分枝桿菌菌種類型。

2 結 果

2.1 oxyR-ahpC間隔區PCR擴增 結核桿菌標準株H37Rv的oxyR-ahpC間隔區片段PCR擴增產物大小為約700bp,而6株臨床分離株中有2株(FJ07008,ZJ06019)的oxyR-ahpC基因間隔區PCR產物明顯的長度大于1 000bp,與胞內分枝桿菌的擴增產物相同。見圖1。

圖1 oxyR-ahpC間隔區PCR擴增產物電泳結果Fig.1 PCR amplification of oxyR-ahpC intergenic-spacer region gene

2.2 測序分析 對oxyR-ahpC間隔區PCR產物測序,與公共數據庫(GenBank database,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)作DNA序列同源性比較,本次是在片段大小相同的同個區域進行比較,FJ07008和ZJ06019與結核分枝桿菌H37Rv的該片段序列差異很大,同源性為84%;與胞內分枝桿菌的該片段相似性高,同源性為99%,見表1。

表1 在NCBI上blast比較oxyR-ahpC間隔區 DNA序列同源性Table 1 Blastn of test strains about oxyR-ahpC intergenic-spacer region on NCBI

2.3 多位點PCR擴增 根據文獻報道的凝膠電泳圖譜〔4〕,臨床菌株FJ07003,XJ06186和結核分枝桿菌H37Rv 7個基因位點的電泳條帶均為陽性,FJ07008和ZJ06019和鳥結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌的第一個基因位點的電泳條帶均為陽性,其余為陰性,故判斷 FJ07008和ZJ06019兩株臨床菌株為非結核分枝桿菌,見圖2。

圖2 多位點PCR擴增結果Fig.2 Multi-locus PCR amplification of seven genes

2.4 hsp65 PCR-RFLP 根據文獻報道的凝膠電泳圖譜〔6〕判斷,FJ07008和ZJ060192株菌和胞內分枝桿菌菌株兩種酶切后的電泳圖條帶一致,而FJ07003,XJ06186和結核桿菌H37Rv電泳圖條帶一致,故判斷FJ07008和ZJ060192株菌為胞內分枝桿菌,見圖3。

圖3 BstpI和HaeIII兩種內切酶酶切鑒定結果Fig.3 Identification of BstpI and HaeIII restrictive enzymes digestion

3 討 論

目前分枝桿菌菌種的鑒定,傳統的分類、鑒定系統主要以形態和生理生化特征的綜合指標為依據,易受多種因素影響,鑒定結果極不可靠,存在著很大的異質性,鑒定一種菌種費時,約4周,還不包括培養所需時間 4-8周。因此有其局限性〔2〕。如PNB、TCH鑒別培養基進行菌種鑒定,雖然已被常規應用,但其為臨床提供信息慢,而且鑒定出的菌種有一定局限性,只能區分至結核分枝桿菌,非結核分枝桿菌和牛分枝桿菌,不能進一步進行種的鑒定〔7〕。

目前,應用分子生物學技術鑒定分枝桿菌菌種不僅快速可靠,而且具有成本低廉,可建立標準化操作程序的優點,成為快速鑒定分枝桿菌的新方法〔2〕。同時本次實驗采用軟件比對并利用網絡生物信息資源對PCR產物異常結果進行判斷等基本生物信息學技術,不僅有助于我們更好的認識臨床菌株,還為進一步實驗提供了線索。生物信息學技術則是通過對生物學實驗數據的獲取、加工、存儲、檢索與分析,達到揭示數據所蘊含生物學意義之目的〔8〕。

NTM 廣泛分布于自然界,在水、土壤、塵埃、人及動物體內普遍存在〔9〕。作為NTM 之一的鳥-胞內分枝桿菌復合菌群包括鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌兩個種,28個血清型,僅從表型上難以進行區分。國內外的研究認為鳥-胞內分枝桿菌復合體主要是以機會感染的方式在兒童和免疫缺陷病人中發生〔9〕。由于AIDS的流行,鳥-胞內分枝桿菌復合體的感染也日趨引起人們的重視。在AIDS患者中,在無菌種鑒定結果的情況下,容易與結核病混淆,但是藥物敏感性不同,許多非結核分枝桿菌耐藥性更強,而化療方案應根據不同菌種來制定〔10〕。因此能快速、準確鑒定出分枝桿菌類型,不僅對臨床診斷和治療,而且在流行病學上均有重要意義。

我們在進行結核分枝桿菌臨床分離株的oxyR-ahpC間隔耐藥區的PCR檢測的過程中,發現用PNB、TCH鑒別培養基鑒定為結核分枝桿菌的兩株分枝桿菌臨床分離株的PCR擴增產物的分子量明顯大于結核分枝桿菌,而與胞內分枝桿菌相同,通過聯合應用多種分子生物學技術和生物信息學技術對這兩株菌株進行定種鑒定,最終確定為胞內分枝桿菌。并為探索新菌種鑒定的特異位點和菌種鑒定技術體系提供初步基礎。

本研究中選用的hsp65基因廣泛地存在于分枝桿菌中,該基因核苷酸序列的多態性總體上大于16S rRNA基因的多態性,其核苷酸位點的變化具有種的特異性,適合用于對分枝桿菌菌種類型進行區分〔10〕。用 PCR-RFLP方法分析 hsp65基因,能夠將分枝桿菌鑒定到種的水平,尤其是可以將鳥-胞內分枝桿菌復合體內菌種鑒別〔5〕。臨床菌株的菌種鑒定往往要求快速、敏感、準確、簡便,以PCR為基礎的分子生物學菌種鑒定技術即具有此特點。但是正是由于分子生物學方法敏感度高,極易因造成實驗室交叉污染而出現假陽性結果,因此需要嚴格控制實驗條件〔10〕。

〔1〕Donnabella V,Salazas SJ,Bonk S,et al.Increasing incidence of Mycobacterium xenopi at Bellevue hospital:an emerging pathogen or a product of improved laboratory methods〔J〕.Chest,2000,118(5);1365-1370.

〔2〕靳曉紅,劉元東,莊玉輝,等.分枝桿菌菌種的基因快速鑒定技術〔J〕.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊,2002,23(2):89-90.

〔3〕Embden JD,Cave MD,Crawford JT,et al.Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting:Recommendations for a standardized methodology〔J〕.Clin Microbiol,1993,31(8):446-2450.

〔4〕Huard RC,Lazzarini LC,Butler WR,et al.PCR-Based Method to Differentiate the Subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions〔J〕.Journal of Clinical Microbiology,2003,41(4):1637-1650.

〔5〕Brunello F,Lig ozzi M,Christelli E,et al..Dentification of 54 Mycobacterium species by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene〔J〕.Clin Microbiol,2001,39:2799-2806.

〔6〕Chimara E,Ferrazoli L,Ueky SY,et al.Reliable identification of mycobacterialspecies by PCR-restriction enzyme analysis(PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequence-based extended algorithm of PRA-hsp65 patterns〔J〕.BMC Microbiology,2008:(8);48.

〔7〕劉金偉,匡鐵吉,王全河,等.分枝桿菌鑒定方法的比較研究〔J〕.中華結核和呼吸雜志,2000,22(10):631.

〔8〕Lesk AM.Introduction to Bioinformatics〔M〕.New York:Oxford University Press,2002:1-61.

〔9〕Koh W,Kwon OJ,Lee KS.Nontuberculous Mycobacterial pulmonary diseases in immunocompetent patients〔J〕.Korean Journal of Radiology,2002,3(3):145-157.

〔10〕Katoch V M.Infections due to non-tuberculous mycobacteria〔J〕.Indian J M ed Res,2004,120:290-304.