剛地弓形蟲細胞培養(yǎng)上清對人結(jié)腸癌細胞sw480增殖與凋亡的影響

高 劍,葉 彬,武衛(wèi)華

剛地弓形蟲(Toxoplasma gonadii)是一種廣泛存在于人和動物的專性細胞內(nèi)寄生原蟲,蟲體侵入細胞后均可誘導細胞凋亡和壞死,其中細胞壞死主要是蟲荷增殖到一定程度脹破胞膜所致,而對宿主細胞的凋亡則依賴于分泌某些特殊物質(zhì)。弓形蟲速殖子與宿主細胞相互作用的研究一直受到關(guān)注,但大多數(shù)探索建立于動物細胞〔1〕和組織模型〔2〕基礎(chǔ)并以更深入挖掘弓形蟲致細胞病變效應(yīng)為初衷,以更好地防治弓形蟲病為目的。對于弓形蟲殺傷腫瘤細胞的生物活性探索尚少,迄今為止只有弓形蟲誘導人白血病細胞K562凋亡的報道〔3〕。弓形蟲侵入細胞后,宿主細胞的歸宿與蟲株毒力和感染強度,以及細胞種類均有關(guān)系,對吞噬性細胞以致其壞死為主,對非吞噬性細胞則以誘導其凋亡為主〔4〕。感染了弓形蟲的宿主細胞,可抵御多種誘導物引發(fā)的細胞凋亡,此種現(xiàn)象可能與弓形蟲維持宿主細胞存活保證自身蟲荷增殖有關(guān),涉及多種機制〔5-11〕,且經(jīng)弓形蟲感染的細胞可分泌某些活性物質(zhì)于培養(yǎng)基中,從而誘導未遭受感染的“旁觀者”細胞凋亡〔12〕。據(jù)國內(nèi)外學者報導,剛地弓形蟲國際標準強毒株RH株速殖子具有細胞寄生廣譜,感染速度快,細胞病變明顯等特點,且其培養(yǎng)上清亦有一定誘導細胞凋亡的效力〔12-13〕,本文以人結(jié)腸癌細胞sw480細胞系為體外研究對象,建立人結(jié)腸癌細胞sw480細胞系與弓形蟲速殖子體外共培養(yǎng)模型并提取培養(yǎng)上清,初步探索這種培養(yǎng)共上清對sw480細胞增殖和死亡方式的影響,以期從弓形蟲感染腫瘤細胞過程中發(fā)現(xiàn)能殺傷腫瘤細胞的活性成分。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 蟲株及細胞 弓形蟲RH株由山西醫(yī)科大學寄生蟲學教研室提供;人結(jié)腸癌sw480細胞、人宮頸癌Hela細胞分別由重慶醫(yī)科大學病理生理學教研室和生化與分子生物學教研室提供。

1.1.2 試劑及儀器 Ckk-8細胞生長檢測試劑盒購自日本株氏會社同仁化學研究所,DMEM、PRMI-1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青產(chǎn)品,細胞凋亡ANNEXIN-V-FITC染色試劑盒為美國Bipec產(chǎn)品,Hochest33258細胞凋亡染色試劑盒、DNA ladder試劑盒為南京凱基生物有限公司產(chǎn)品,瓊脂糖、100 bp DNA標志物為天根生物工程有限公司產(chǎn)品,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。細胞培養(yǎng)和檢測儀器均由重慶醫(yī)科大學分子與腫瘤研究中心和生命科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲速殖子懸液的制備 收集人宮頸癌細胞Hela細胞系體外培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)基,4%胎牛血清,100U/mL氨芐青霉素,100U/mL硫酸鏈霉素)3～5d的弓形蟲細胞混合懸液,3 000r/min離心10min去上清,以胰酶消化法結(jié)合Ficoll-Urografin密度梯度離心法〔14〕純化蟲體并以PRMI-1640培養(yǎng)基,4%胎牛血清,100U/mL氨芐青霉素,100U/ml硫酸鏈霉素制備成速殖子懸液。

1.2.2 弓形蟲速殖子和sw480細胞共培養(yǎng)模型的建立及共培養(yǎng)上清的收集 人結(jié)腸癌sw480細胞以PRMI-1640培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清,100U/ml氨芐青霉素,100U/ml硫酸鏈霉素為培養(yǎng)基環(huán)境,置37℃的5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。收集傳代72h后的細胞制成1×106/mL細胞懸液,接種至50 mL培養(yǎng)瓶,足量培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,換液并分別接種不同濃度(2×106/mL、4×106/mL、8×106/mL、16×106/mL)的弓形蟲速殖子懸液各1mL,并添加新鮮培養(yǎng)基至3mL/瓶。將所建立模型分別命名為A、B、C、D組。

常規(guī)培養(yǎng)上述各組模型72 h,將培養(yǎng)液以2 500 r/min離心 10 min,收集所得上清液,以直徑為0.22 μ m的無菌濾器過濾,將濾液分裝至1.5mL無菌EP管中,-20℃凍存,用前以 37℃水浴迅速融化。

1.2.3 吉氏染色觀察弓形蟲速殖子在sw480細胞內(nèi)的寄生 將常規(guī)培養(yǎng)的sw480細胞以5×104/mL接種于24孔細胞培養(yǎng)板中,每孔1 mL,24h后吸棄培養(yǎng)液接種入1×106/孔弓形蟲速殖子懸液,倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況,48 h后以細胞刮匙收集孔中細胞,1 500 r/min,離心10 min涂片,常規(guī)吉氏染色,油鏡觀察并拍照。

1.2.4 Ckk-8比色法觀察sw480細胞抑制率 取對數(shù)生長期密度為5×104/mL的sw480細胞,接種于3個96孔培養(yǎng)板上,100μL/孔。常規(guī)培養(yǎng)過夜,吸棄培養(yǎng)基,分別加入制備好的A、B、C、D各模型組共培養(yǎng)上清(50μL/孔),并以新鮮培養(yǎng)基添補至100μL/孔,每組設(shè)5個復(fù)孔。對照組加入等體積新鮮培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。實驗終止前2h每孔加入ckk-8試劑10μL,培養(yǎng)結(jié)束時以酶標儀檢測吸光度(A450值),按公式計算sw480細胞抑制率。重復(fù)操作3次。

1.2.5 流式細胞儀測細胞凋亡與壞死率 取對數(shù)生長期sw480細胞(密度為2×106/瓶)接種于 5個50 mL培養(yǎng)瓶中,常規(guī)培養(yǎng)過夜,取其中4瓶作為實驗組分別加入上述4種模型的共上清液3 mL,以新鮮培養(yǎng)基添補至終體積6 mL,對照組加入6 mL新鮮培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,細胞刮匙收集細胞,制備單細胞懸液,調(diào)細胞濃度為106/mL,取細 胞懸液 25μL 加 入 500μL 的 Binding Buffer懸浮細胞,加入 5μL Annexin-v-FITC 混勻后,加入5μL PI混勻,室溫避光反應(yīng)10 min后進行FACScan檢測。

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳分析凋亡細胞DNA片段化 按照1.2.5的方法收集sw480細胞,按照凱基細胞凋亡 DNAladder試劑盒說明操作。所提取DNA以TE buffer充分溶解,1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min,紫外透射儀觀察并拍照。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察 sw480細胞凋亡 按照1.2.5的方法制備細胞懸液,收集5×105個細胞(作用時間為48h),4℃PBS洗2遍,1 000 r/min離心5 min,4%多聚甲醛℃固定10 min,1 000 r/min離心10min,所得沉淀以50～ 100μL PB S 重懸,涂片,自然晾干,Hochest33258染料1∶10稀釋成工作液濃度,50～100μL常溫避光染色10 min,水沖洗晾干,340 nm紫外光激發(fā)熒光顯微鏡觀察。

1.2.8 凋亡與壞死細胞透射電鏡樣品制備與觀察按照1.2.5的方法制備細胞懸液,離心收集細胞,迅速以4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定細胞2 h以上,再用鋨酸進行雙重固定。經(jīng)梯度乙醇脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片。醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色后,透射電鏡下觀察并照相。

1.3 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 弓形蟲RH株速殖子與人結(jié)腸癌sw480細胞體外共培養(yǎng)模型 以24孔板常規(guī)培養(yǎng) sw480細胞,傳代過夜后添加RH株速殖子懸液并繼續(xù)培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察可見3～5d細胞病變明顯,貼壁細胞成批脫落,并呈圓球狀懸浮于培養(yǎng)孔中,細胞刮匙搜集孔底和孔中細胞離心涂片吉氏染色并觀察發(fā)現(xiàn)典型弓形蟲寄生現(xiàn)象(圖1),證明弓形蟲 RH株速殖子可在sw480細胞中寄生,體外共培養(yǎng)模型建立條件成熟。

圖1 吉氏染色觀察弓形蟲RH株速殖子在sw480細胞內(nèi)寄生并增殖Fig.1 The parasitism and proliferation in sw480 cells of Toxoplasma gondii tachyzoites(Giemsa staining,×1000)

2.2 共培養(yǎng)上清對sw480細胞增殖的抑制作用將上述A、B、C、D四個模型組提取的弓形蟲速殖子與sw480共培養(yǎng)上清分別作用于sw480細胞12h、24 h、48 h,cck-8法檢測細胞A(450)值并計算抑制率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)12h各實驗組與對照組相比對細胞的生長抑制均不明顯,原培養(yǎng)模型中蟲數(shù)較低的A、B、C 3組所得共上清甚至表現(xiàn)出促進sw480生長的作用,24 h后各模型組共上清對sw480細胞的生長均有不同程度的抑制作用,且隨著作用時間的增加,sw480細胞抑制率也增加,其中以C組模型共上清(蟲/細胞為8∶1組)對細胞的增殖抑制作用尤為明顯,48h細胞增殖抑制率可達44.55%。各實驗組抑制率與對照組比較(表1),差異顯著(P＜0.05)。

表1 共培養(yǎng)上清作用后的sw480細胞抑制率Table 1 Inhabitation ratio of proliferation of sw480cell treated with different models of supernatant

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 各共培養(yǎng)模型組培養(yǎng)上清分別作用 sw480細胞24、48、72 h,流式細胞儀檢測結(jié)果如表2,結(jié)果顯示24 h后相對于對照組,各實驗組細胞早期凋亡率和晚期凋亡與壞死共同率已有明顯增加,作用48h時各實驗組早期凋亡率均達到最大值,其中D模型組(蟲/細胞=16:1)達到最大早期凋亡率11.54%,48h后各實驗組細胞晚期凋亡和壞死率明顯增加,早期凋亡率開始減少。處理72h的C模型組(蟲/細胞=8∶1)上清致細胞總死亡率可達46.11%,殺傷效果在各實驗組中最為明顯。

表2 不同模型組培養(yǎng)共上清作用sw480細胞不同時間后細胞凋亡率和壞死率Table 2 Effect of culture supernatant of Toxoplasma on apoptosis and necrosis of sw480 cell at different models and different time points.

2.4 細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果不同培養(yǎng)模型的弓形蟲速殖子與sw480細胞培養(yǎng)共上清孵育sw480細胞72 h,其DNA電泳均出現(xiàn)了相差約200 bp的DNA梯形條帶(圖2),此為凋亡細胞特有,且只有樣品中晚期凋亡細胞達30%作用方可見明顯的DNA梯狀條帶,進一步表明經(jīng)培養(yǎng)上清處理72 h后,sw480細胞確實發(fā)生細胞凋亡,且由前述流式細胞術(shù)分選出的晚期凋亡和壞死細胞群落中,多是由凋亡細胞產(chǎn)生的繼發(fā)性壞死,晚期凋亡細胞占主要分選成分。

圖2 sw480細胞DNA凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of sw480 DNA

2.5 熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài) 選擇各模型共培養(yǎng)上清作用 48h細胞后置熒光顯微鏡下觀察(圖3),可見實驗組中凋亡細胞因核染色質(zhì)聚集對hochest33258染料吸收較強而發(fā)出強而亮的藍色熒光,且可看到核固縮,胞核碎裂等典型細胞凋亡特征。而對照組正常sw480細胞只發(fā)出微弱均勻的淡藍色熒光,壞死細胞不著色,故可證明實驗組視野下細胞群落多為凋亡細胞。

2.6 透射電鏡觀察細胞形態(tài)取以蟲/細胞為8∶1的RH株速殖子與sw480細胞共培養(yǎng)上清作用48h后的sw480細胞常規(guī)制備透射電鏡樣品做鏡下觀察(圖4),可見正常sw480細胞呈不規(guī)則橢圓形或多角形,核較大,核仁明顯;壞死細胞輪廓不清,胞膜完整性破壞,胞質(zhì)呈空泡狀改變;凋亡細胞呈現(xiàn)典型的核染色質(zhì)固縮,核塊狀化碎裂,但胞膜尚完整。

3 討 論

凋亡和壞死是細胞死亡的兩大形式,所有腫瘤體外藥敏試驗的研究探索,大多是圍繞抑制腫瘤細胞增殖、殺傷腫瘤細胞和誘導腫瘤細胞凋亡這三個方向開展的。在開發(fā)抗腫瘤新藥的過程中,各種干預(yù)物質(zhì)對腫瘤細胞生長特性的影響研究是后續(xù)一系列生物藥理活性和臨床應(yīng)用研究工作的基石。剛地弓形蟲作為細胞內(nèi)寄生性原蟲物種,其與腫瘤細胞之間的相互作用能夠為研發(fā)抗腫瘤新藥開辟一個新的視點。

以往的研究工作中,大多以動物模型和病理組織作為研究材料來進一步探索弓形蟲的致病機理,研究雖然已經(jīng)深入到細胞層面,但更多探索的是弓形蟲對正常細胞的致害效應(yīng)。而弓形蟲對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)研究鮮少。考慮到弓形蟲體內(nèi)寄生時可控性和觀察檢測上的難度,以具有致細胞凋亡作用的弓形蟲培養(yǎng)上清作為干預(yù)手段,則從藥物可控性和蟲種培養(yǎng)利用上,較直接利用弓形蟲速殖子蟲株具有更加安全、經(jīng)濟的意義。

細胞培養(yǎng)和昆明小鼠腹腔接種是目前國內(nèi)外實驗室培養(yǎng)弓形蟲最常用的方法〔15〕,而任何一種弓形蟲速殖子的純化方法都不能達到100%的純化率〔16〕。考慮到體外細胞研究必需避免污染和細胞雜交等情況的發(fā)生,本研究選擇以作為研究對象的人結(jié)腸癌細胞sw480擔當飼養(yǎng)細胞株來培養(yǎng)弓形蟲速殖子并制備上清,一方面為弓形蟲的細胞培養(yǎng)途徑探索到了新的飼養(yǎng)細胞株種,同時避免了后續(xù)研究的各種混淆因素。

本研究采用Ckk-8細胞生長測定方法,較國內(nèi)普遍采用的MTT細胞生長測定法更為靈敏且重復(fù)性好,可確證此種培養(yǎng)共上清對sw480細胞增殖的抑制作用。在對細胞死亡方式的檢測中,單一技術(shù)和檢測方法說服力差且假陽性高,故而需采用多種檢測方法分別從細胞凋亡率,細胞凋亡時期,細胞凋亡形態(tài),凋亡細胞核苷酸片段化等層面對此培養(yǎng)上清的凋亡誘導效應(yīng)進行嚴謹檢測。其中Annexin-v-FITC雙染法結(jié)合流式細胞技術(shù)不僅能精確計算細胞凋亡率,且可分選出早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞,已成為國內(nèi)外廣泛采用的較精確的細胞凋亡檢測手段〔17〕。凋亡最突出的生化特征是內(nèi)源性Ca+/Mg+依賴性核酸內(nèi)切酶的活化在小體連接區(qū)切割DNA雙鏈,使DNA降解成200 bp或其整數(shù)倍的寡核苷酸片段。細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳分析可進一步確證凋亡細胞的存在。在細胞形態(tài)學檢測上,透射電鏡可清晰顯示凋亡細胞的核固縮核碎裂現(xiàn)象以及壞死細胞的膜空泡狀和胞膜破裂改變,但電鏡視野單一,必須結(jié)合光鏡視野以確定凋亡細胞群落的存在,Hochest33258熒光染料作為常用的DNA特異性染料,可清楚顯示出凋亡細胞核染色質(zhì)的凝集、邊緣化特征,且可避免壞死細胞對觀察視野的混淆。

本研究通過一系列檢測手段已確證弓形蟲速殖子與sw480細胞的共培養(yǎng)上清不僅能夠抑制體外sw480細胞的增殖,還可誘導其凋亡和壞死。其影響sw480細胞增殖和存活的機制尚不可知,推測與感染細胞釋放于培養(yǎng)基中的某些活性成分有關(guān)。國內(nèi)外〔12,18〕均報導由弓形蟲速殖子誘導的細胞凋亡與一氧化氮(NO)介導的細胞凋亡有關(guān),但不知此種機制是否同樣參與共上清誘導腫瘤細胞凋亡的過程中,故計劃下一步先檢測弓形蟲感染腫瘤細胞過程中一氧化氮(NO)量的變化,再通過對NO介導的細胞凋亡機制的研究,深入挖掘培養(yǎng)共上清誘導細胞凋亡和壞死的機制,并分析此共上清中的活性成分,從而為弓形蟲速殖子與人腫瘤細胞培養(yǎng)共上清的抑瘤作用,提供更詳盡深入的科學依據(jù)。

本研究中還觀察到弓形蟲速殖子與宿主細胞相互作用的另一個現(xiàn)象有待進一步研究。即蟲/細胞為8∶1的共培養(yǎng)模型所得上清,對細胞增殖抑制和促細胞凋亡與壞死效力表現(xiàn)均較蟲/細胞為16∶1的共培養(yǎng)模型所得上清突出。推測共培養(yǎng)模型所得上清殺傷腫瘤細胞的效力與培養(yǎng)模型中蟲荷與細胞數(shù)目的比例有關(guān),只有蟲荷與細胞比例合適,蟲感染細胞的空間合適,所得上清發(fā)揮抑制細胞增殖和殺傷細胞的效力方可達明顯效果。

〔1〕孟曉麗,殷國榮,劉紅麗,等.RH株弓形蟲速殖子體外入侵大鼠腸上皮細胞與增殖的動態(tài)觀察〔J〕.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2009,27(1):39-42.

〔2〕殷國榮,韓劍峰,劉紅麗,等.經(jīng)口感染弓形蟲誘導的小鼠腸道粘膜T細胞亞群變化〔J〕.中國寄生蟲病防治雜志,2004,17:199-202.

〔3〕張秀昌,蔡念光,孫黎,等.弓形蟲誘導人白血病細胞K562凋亡的實驗觀察〔J〕.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2007,25(3):185-188.

〔4〕李立偉,邵浙新,嚴 杰.剛地弓形蟲對HUVEC、Vero和 J774A-1、THP-1侵入的比較研究〔J〕.中國人獸共患病學報,2006,22(7):597-600.

〔5〕Nash PB,Purner MB,Leon RP,etal.Toxoplasma gondii infected cells are resistant to multiple inducers of apoptosis〔J〕.J Immunol,1998,160:1824-1830.

〔6〕Heussler VT,Kuenzi P,Rottenberg S.Inhibition of apoptosis by intracellular protozoan parasites 〔J〕.Int J Parasitol,2001,31:1166-1176.

〔7〕Goebel S,Gross U,Luder CG.Inhibition of host cell apoptosis by Toxoplasma gondii is accompanied by reduced activation of the caspase cascade and alterations of poly(ADP-ribose)polymerase expression〔J〕.J Cell Sci,2001,114:3495-3505.

〔8〕Nishikawa Y,Makala L,Otsuka H,et al.Mechanisms of apoptosis in murine broblasts by two intracellular protozoan parasites,Toxoplasma gondii and Neospora caninum 〔J〕.Parasite Immunol,2002,24:347-354.

〔9〕Payne TM,Molestina RE,Sinai AP.Inhibition of caspase activation and a requirement for NF-kβ function in the Toxoplasma gondii mediated blockade of host apoptosis 〔J〕.J Cell Sci,2003,116:4345-4358.

〔10〕Molestina RE,Payne TM,Coppens I,et al.Activation of NF-kβ by Toxoplasma gondii correlates with increased expression of antiapoptotic genes and localization of phosphorylated IkB to the parasitophorous vacuole membrane〔J〕.J Cell Sci,2003,116:4359-4371.

〔11〕Sinai AP,Payne TM,Carmen JC,et a1.M echanisms underlying the manipulation of host apoptotic pathways by Toxoplasma gondii〔J〕.Int J Parasitol,2004,34(3):381-391.

〔12〕Nishikawa Y,Kawase O,Vielemeyer O,et al.Toxoplasma gondii infection induces apoptosis in noninfected macrophages:role of nitric oxide and other soluble factors〔J〕.Parasite Immunology,2007,29:375-385.

〔13〕張改,葛以躍,吳江平,等.弓形蟲培養(yǎng)上清體外對細胞的影響〔J〕.中國血吸蟲病防治雜志,2007,(3):196-199.

〔14〕鄭煥欣,陳發(fā)凱,陳觀今.一種新的弓形蟲速殖子純化方法〔J〕.中國寄生蟲病防治雜志,1993,6(2):146.

〔15〕陳永軍,王權(quán),龔朋飛,等.弓形蟲兩種保種方法的實驗〔J〕.中國獸醫(yī)寄生蟲病,2007,15(5):22-24.

〔16〕陳觀今.中國對弓形蟲體外培養(yǎng)和分離純化的研究〔J〕.熱帶醫(yī)學雜志,2000,00:64-67.

〔17〕彭黎明,江虹,Chris Bradley.細胞凋亡和繼發(fā)性壞死的 Annexin法定量檢測〔J〕.華西醫(yī)大學報,2001,32(4):602-604.

〔18〕楊麥貴,楊陽,黃萍,等.男性不育精液中NO的含量與生殖細胞凋亡的關(guān)系〔J〕.細胞與分子免疫學雜志,2005,21(4):510-513.