參元丹晚期藥理預適應對大鼠缺血再灌注心肌PKC及HSP70的影響1)

楊洪志,尚菊菊,溫慶祥,李愛勇,劉衛紅,耿建國,劉紅旭

缺血性預適應(ischemic preconditioning,IPC)是一種內源性保護機制,即短暫的缺血后能耐受隨后較長時間的缺血損傷。藥理性預適應就是用藥物替代缺血產生缺血預適應樣保護作用。IPC介導的心肌保護作用發生于兩個不同的時相。早期預適應(early protection,EP)于IPC后立即出現,2 h～3 h消失。之后數小時后出現第二窗的晚期預適應(delayed protection,DP)。現對益氣逐瘀法預適應大鼠缺血再灌注心肌蛋白激酶C(PKC)及熱休克蛋白(HSP)的影響進行研究,以期闡明益氣逐瘀中藥的藥理預適應性的心臟保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年Wistar大鼠140只,雌雄各半,體重274 g±42 g,鼠齡4月左右,SPF級。由北京天橋實驗動物技術有限公司提供。大鼠飼養和實驗均在北京市中醫研究所SPF級實驗動物室內進行(實驗動物室許可證號:SCXK11-00-0008)。

1.2 藥物與器械 參元丹(SYD)膠囊為北京中醫醫院院內制劑,主要組方:黃芪、黨參、元參、丹參、土元、水蛭等,批號:京藥制字Z20053327,北京中醫醫院藥劑科制。根據臨床參元丹應用劑量,等效換算后的7倍劑量為大鼠灌胃劑量。戊巴比妥鈉(BDH,AR級,使用前用滅菌注射用水配制成3%的濃度)。四通路生理記錄儀(型號:AD INSTRUM ENTS Powerlab),動物用呼吸機(型號:VL-8,上海奧爾科特科技有限公司)、721型光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠制造)、離心沉淀機(型號:Sigma-3-18K)、北航三高CMIAS99C型彩色病理圖像分析儀等。

1.3 動物模型制備 心肌梗死模型制作參考陳金星等[1]方法。機械性缺血預適應模型的參考心肌梗死模型制作方法。

1.4 分組及給藥方法 將大鼠隨機分為6組,每組10只,雌雄各半。對照組(control):不做任何處理;再灌注組(IR):缺血 30 min,再灌2 h;晚期假性缺血預處理組(SIPC/SWOP):3個機械性缺血預適應時只穿線,恢復24 h后,進行再灌注組過程;晚期缺血預處理組(IPC/SWOP):3個機械性缺血預適應后,恢復24 h進行再灌注組過程;晚期藥物預處理加缺血預處理組(DIPC/SWOP):灌藥2 h后,進行 3個機械性缺血預適應,恢復24 h后進行再灌注組過程;晚期藥物預處理組(DIR/SWOP):灌藥24 h后,進行再灌注組過程。

處理方法:末次給藥2 h后戊巴比妥鈉腹腔麻醉,50 mg/kg,將動物背位固定在鼠臺上,用6號針頭置于四肢皮下,并與心電圖機肢導聯相連,監測Ⅱ導聯心電圖麻醉后和梗死后的變化,根據Ⅱ導聯心電圖的變化,以T波改變判斷心肌缺血程度和藥物作用。觀察2 h后心臟取血,檢測生化指標。取血后,沿左右心耳剪取心臟,保留心耳以下部分,浸入甲醛溶液固定,72 h后脫水,包埋,制成蠟塊,以備染色及切片。

部分組織標本浸入10%中性甲醛液中固定72 h后,逐級乙醇脫水,石蠟包埋,卡切片機間斷均勻切片,57攝氏度水浴撈片,烘片機烘干,制成組織切片備檢。對病理切片進行免疫組化染色,光學顯微鏡觀察受損血管病理組織形態學改變,協同使用彩色病理圖像分析,測定PKC及HSP70表達情況。

2 結 果

經HE染色后,20倍光學顯微鏡下觀察,梗死組織細胞腫脹、變形,細胞之間的界限不明顯,甚至很多細胞破裂,細胞質流入細胞間隙。細胞間質增生,細胞排列雜亂。

2.1 各組不同的處理方法對大鼠心肌梗死面積的影響 對照組以心尖至切取部位最短垂直距離為測量標準,其余各組以心尖至梗死部位的最短垂直距離為測量標準,反映心肌梗死面積的大小。晚期缺血預處理組、晚期藥物預處理加缺血預處理組、晚期藥物預處理組與再灌注組比較,梗死面積均減小(P＜0.01)。SYD能夠代替心絞痛的缺血、缺氧的刺激,減小心肌梗死面積,具有晚期藥理性預適應的心臟保護作用。詳見表1。

表1 各組心尖至梗死部位的最短垂直距離(±s)

表1 各組心尖至梗死部位的最短垂直距離(±s)

組別 n 最短垂直距離(μ m)對照組 10 246.50±8.18再灌注組 10 85.50±13.631)晚期假性缺血預處理組 10 88.70±10.511)晚期缺血預處理組 10 144.10±21.921)2)晚期藥物預處理加缺血預處理組 10 150.10±20.311)2)晚期藥物預處理組 10 113.90±7.351)2)與對照組比較,1)P＜0.01,與再灌注組比較,2)P＜0.01

2.2 PKC的表達情況分析 PKC主要表達在細胞質和細胞膜,在細胞核上很少表達。它的經典表達方式是圍繞著藍色細胞核的棕褐色分布,而形成了大體的細胞形狀。PKC在正常的心肌細胞中基本不表達,或者僅有少量的表達,這種表達在顯微鏡下肉眼難以看到。所以,排除特殊情況后,PKC一旦表達成陽性,就說明這種表達有意義。

在對照組和再灌注組的心肌組織中,PKC基本不表達;晚期假性缺血預處理組、晚期藥物預處理加缺血預處理組、晚期藥物預處理組亦沒有PKC表達。晚期缺血預處理組大鼠心肌組織中,PKC表達為細胞核,考慮屬于表達失真。由于同時實驗的其他組并無此失真情況發生,考慮可能的原因有3種:一是鏡下控制顯色的時間過長;二是晚期缺血預適應和參元丹的效應促使PKC在細胞核上表達;三是其他未知的原因發生。

2.3 HSP70的表達情況 HSP70在正常的心肌細胞中基本不表達,或者僅有少量的表達,這種表達在顯微鏡下肉眼難以看到。對照組、再灌注組和晚期假性缺血預處理組的HSP70沒有表達。HSP70表達豐富,即晚期缺血預處理組和晚期藥物預處理組加缺血預處理組的HSP70大量表達,說明缺血預處理的心肌保護作用機制與HSP70有關,與文獻報道相符[2]。晚期藥物預處理組加缺血預處理組的HSP70表達有SYD作用存在;參元丹的心肌保護作用機制與HSP70有關。

3 討 論

1986年M urry等[3]首次在犬心報道,并將此現象命名為IPC。IPC的機制是通過觸發體內某些活性物質的活性,隨后激活某些細胞內的信號傳導途徑,激活后的信號傳導途徑通過一些效應因子而發揮心肌保護作用。ATP敏感鉀通道是受體激活后的效應因子最終作用部位。IPC介導的心肌保護作用發生于兩個不同的時相。PKC主要在快速相中起作用,HSP主要在延遲相中起作用[4,5]。

缺血預適應對于心肌具有強大的保護作用,但不能應用于臨床,因此,藥理性預適應的研究應運而生。SYD治療不穩定心絞痛(血瘀證)臨床綜合療效總有效率在87.1%～91.3%。部分療效機制可能與促進血管內皮修復有關[6-8]。SYD可以拮抗PHE引起的血管平滑肌收縮、抗垂體后葉素引起的大鼠急性心肌缺血、降低大鼠急性心肌缺血時血漿NE、DA及ET、ET/NOS比值的升高、抑制動脈內皮損傷后血管內膜過度增生、調整動脈內皮損傷大鼠ET/NOS比值及AngⅡ水平[9-12]。

本研究顯示,SYD具有晚期藥理預適應樣作用;晚期假性缺血預處理組、晚期藥物預處理加缺血預處理組、晚期藥物預處理組沒有PKC表達,提示PKC沒有參與晚期缺血預適應的細胞內信號轉導。晚期缺血預處理組、晚期藥物預處理加缺血預處理組均有HSP70大量表達,晚期藥物預處理組亦有HSP70表達,提示晚期缺血預處理的心肌保護作用機制與HSP70有關,SYD具有獨立的晚期藥理預適應作用,晚期藥物預處理組加缺血預處理組的HSP70表達有SYD作用存在;SYD的心肌保護作用機制與HSP70有關。

SYD具有晚期藥理預適應樣心肌保護作用,減小心肌梗死面積;SYD晚期預適應心肌保護作用的機制可能與HSP70的介導有關;SYD晚期預適應可能與缺血預適應協同發揮心肌保護作用。

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