溫度對綠僵菌LA菌株孢子萌發、酶活力及毒力的影響

岳 梅, 雷仲仁, 孟 濤, 王兆勇, 姚君明

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

綠僵菌是蟲生真菌主要類群之一,寄主范圍廣,能寄生8目30科約200種昆蟲、螨類及線蟲[1],是當今蟲生真菌研究的主要對象之一。影響綠僵菌生長和生理代謝的因素較多,其中溫度是最重要的因素之一[2],綠僵菌入侵昆蟲的每一步都與溫度緊密相關。

東亞飛蝗是我國歷史上的重要害蟲,其為害植物以禾本科、莎草科為主,至今仍嚴重威脅我國的糧食生產[3]。近年來,全球性氣候變化為蝗災的發生創造了有利條件,加重了蝗災的發生。綠僵菌防治蝗蟲具有很好的效果,但是近些年的研究表明,蝗蟲具有較強的體溫調節行為,當體溫升高至一定程度便能有效地降低綠僵菌的致病力,因此綠僵菌耐受高溫的能力便成為影響病原與寄主互作關系的重要因素。作者即對綠僵菌LA菌株在不同溫度下的萌發率、胞外蛋白酶和幾丁質酶活力以及對東亞飛蝗的毒力進行了研究,并與東亞飛蝗室內接受輻射熱可保持的適宜體溫結合,測定了不同高溫處理下綠僵菌孢子萌發情況,以期明確溫度對綠僵菌與蝗蟲互作的影響。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與菌株

本試驗所用東亞飛蝗系實驗室多年續代飼養,于網室內每天用新鮮玉米葉片和麥麩飼喂的健康群體。

綠僵菌LA菌株,最早分離自天津大港的東亞飛蝗,本實驗室續代保存。

1.2 溫度對LA菌株孢子萌發的影響

采用微室萌發法[4]測定孢子萌發率,取載玻片置于保濕的培養皿中,分別滴入孢子萌發液(1%蛋白胨、1%葡萄糖和0.05%吐溫80)和孢子液各一滴混勻,封口膜密封培養皿,制成萌發微室。萌發率為選定視野內萌發孢子數與總孢子數的比值,每次計數5個視野求平均值。

1.2.1 不同溫度下孢子萌發速率

將上述培養皿分別置于 20、25、30、35 ℃和40℃人工氣候箱(RXZ智能型,寧波江南儀器廠)內培養,設置溫度的誤差為1℃,箱內濕度保持在40%～50%。4h后開始計數萌發率,每隔4h計數1次,記錄24h。重復3次求平均數。

1.2.2 高溫下孢子萌發速率測定

根據1.2.1部分的結果,設定35～40℃之間每隔1℃為一溫度梯度,即分別將待測孢子置于36、37、38℃和39℃,培養8h后開始測定萌發率,每隔8h計數1次,記錄48h,測定孢子可萌發的最高溫度。重復3次求平均數。

1.2.3 不同高溫處理對孢子萌發速率的影響

用無菌水配制孢子懸浮液,倒入2mL離心管中,分別置于42、45 ℃和 48 ℃水浴中,處理 3、6h和9h,取出后用微室培養法置于30℃下培養,4h后計數萌發率,每隔4h計數1次,記錄 24h。重復3次求平均數。

1.3 溫度對LA菌株酶活力的影響

1.3.1 培養基

SDA 培養基 ：葡萄糖40g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸膏 10g/L。蛋白酶誘導培養基：1%明膠,K2HPO4,NaCl和MgSO4?7H2O 各 0.3g/L。各組分溶入pH7.0的0.02mol/L磷酸緩沖液。幾丁質誘導培養基：蛋白胨0.5%,KH2PO4,KCl,MgSO4?7H2O各0.05%,ZnSO4?7H2O0.1%,脫礦幾丁質1%,pH6.0。

膠體幾丁質的制備：稱取幾丁質25g,85%磷酸250mL,30℃反應1.5d,加蒸餾水待膠體沉淀后,反復水洗至中性,用 0.02mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)調整終濃度至2%。

1.3.2 不同培養時間胞外蛋白酶活力的測定

將少量LA菌粉加入胞外蛋白酶誘導培養基中,30℃,130r/min旋轉式搖床培養,分別提取第3天、第4天、第5天、第6天、第7天的酶液,將2%酪蛋白1mL加入1mL酶液中,40℃反應10min,加2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液中止反應,室溫放置待沉淀完全。用Folin-酚試劑檢測,以每分鐘催化分解1μg酪蛋白的酶量為一個活性單位(U/mL)。重復3次求平均數。

1.3.3 溫度對胞外蛋白酶活力的影響

1.3.4 不同培養時間幾丁質酶活力的測定

將少量菌粉加入到幾丁質誘導培養基中30℃,130r/min旋轉式搖床培養,分別提取第3天、第4天、第5天、第6天、第 7天的酶液,在1mL膠體幾丁質中,分別加入酶液0.5mL,50℃反應1h,用DNS法測定產生的還原糖,以每分鐘產生相當于1μL的NAG所需的酶量定義為一個酶活力單位(U/mL)。重復3次求平均數。

1.3.5 溫度對幾丁質酶活力的影響

取1.3.4中培養第5天的酶液,在1mL膠體幾丁質中 ,加入酶液 0.5mL,20 、25、30、35、40、45、50、55℃下反應1h,用DNS法測定產生的還原糖。以每分鐘產生相當于1μg的NAG所需的酶量定義為一個酶活力單位(U/mL)。重復3次求平均數。

1.4 溫度對LA菌株毒力的影響

配制孢子濃度為2.6×107個/mL,每頭蝗蟲接種0.5μL,設定人工氣候箱溫度分別為 20、25、30、35、40℃5個溫度,選用5齡東亞飛蝗若蟲,每個處理3個重復并設對照,每個重復選用20頭試蟲,每日調查蝗蟲死亡情況并將死蟲保濕培養,記錄15d,計算 LT50和LT90。

1.5 數據處理分析

應用DPS軟件進行數據處理分析并計算LT50、LT90。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下孢子萌發速率

采用微室萌發法測定了不同溫度下LA菌株分生孢子萌發情況,結果如圖1,LA孢子在30℃下4h即有10.2%孢子萌發,8h萌發率達到72.3%,35℃下4h也有5.1%孢子萌發,總體而言,前12h孢子萌發速率依次為30℃＞35℃＞25℃＞20℃＞40℃,LA孢子在20～35℃均可萌發,24h內均能達到90%以上的萌發率,而40℃下24h內孢子無萌發現象。

圖1 溫度對LA分生孢子萌發的影響

2.2 高溫下孢子萌發速率

LA分生孢子在36～39℃下培養48h內孢子萌發情況如圖2所示。溫度每升高1℃,孢子萌發率均有較大程度降低,36℃下48h孢子萌發率達到80.2%,而39℃下僅為10.1%,此溫度范圍屬LA萌發的不適合溫度,高于39℃的環境溫度下分生孢子基本不能正常萌發。

互聯網與通信技術的發展打破了傳統學習的時空約束，改變了學生的學習行為，使學習更具有靈活性和主動性，網絡學習的即時性也最大限度的幫助成人學生克服工學矛盾， 但網絡學習改變成人學習行為的同時也產生了一些消極的影響。在未來成人教育體系中，學生不僅僅是傳統課堂學習的“補充型”學習，而且是終身學習的踐行者，而網絡學習給成人學生的終身學習提供了條件。成人教育的研究者和工作者，應更客觀地看待互聯網在網絡學習中的作用和學生具體學習行為的嬗變，努力揚長避短，使成人學生在網絡學習中朝著更有益的方向發展。

圖2 高溫下LA分生孢子的萌發情況

2.3 不同高溫處理對孢子萌發速率的影響

不同時間高溫處理對孢子萌發率的影響見表1,由表可以看出,隨著處理溫度的升高和處理時間的延長,孢子萌發率均有不同程度的降低,48℃下對孢子萌發影響最大,處理9h后30℃下微室培養24h萌發率僅為10%。42℃和45℃高溫處理轉至30℃下培養24h,孢子萌發率均在85%以上,試驗2.1中未經高溫處理30℃下8h萌發率達70%,而經高溫處理后8h萌發率最高僅為11.7%。整體而言,在本試驗所處理的時間范圍內,48℃下分生孢子受高溫影響,轉至最適培養溫度下也無法正常萌發;42℃和45℃處理一定時間,延緩了孢子的萌發,但不能最終影響孢子萌發率。

2.4 LA菌株胞外蛋白酶活力測定

2.4.1 不同培養時間胞外蛋白酶活力測定

培養第3、4、5、6、7天所得胞外蛋白酶活力曲線如圖3所示,隨著培養天數的增加,酶活力逐漸升高,至第6天達到最高,活力值為31.37U/mL。

表1 不同高溫處理時間對LA孢子萌發率的影響1)

圖3 不同培養時間LA胞外蛋白酶活力

2.4.2 溫度對胞外蛋白酶活力的影響

取培養第6天的蛋白酶液,在不同溫度下反應所得的酶活力結果見圖4,由圖可以看出,37℃左右蛋白酶活力最高,20℃下蛋白酶活力最低,活力值為20.62U/mL,酶活力是一個先增加后降低的過程。

圖4 不同溫度下LA胞外蛋白酶活力

2.5 LA菌株幾丁質酶活力測定

2.5.1 不同培養時間幾丁質酶活力的測定

培養第 3、4、5、6、7天所得幾丁質酶活力曲線如圖5所示,酶活力至第 5天達到最高,活力值為34.62U/mL,之后繼續培養呈下降趨勢。

圖5 不同培養時間LA幾丁質酶活力

2.5.2 溫度對幾丁質酶活力的影響

取培養第5天的幾丁質酶液,在不同溫度下反應所得的酶活力結果見圖6,由圖可以看出,幾丁質酶活力在50℃下最高,活力值為 34.62U/mL,20℃下最低,活力值為23.53U/mL,幾丁質酶活力是一個先增加后降低的過程。

圖6 不同溫度下LA幾丁質酶活力

2.6 溫度對LA菌株毒力的影響

不同溫度下LA對東亞飛蝗5齡若蟲的毒力見表2,由此表可以看出30℃下LT50和 LT90最低,20℃和40℃下致死時間較長,25℃和35℃下致死時間居中,30℃為 LA對東亞飛蝗致病力最強的溫度。

表2 不同溫度下LA對東亞飛蝗致死時間1)

試蟲一般從第3天開始大量死亡,不同溫度下試蟲的累計死亡率見圖7,不同溫度下LA的毒力差異可從死亡曲線的延伸角度和高度直觀看出,30℃下第8天試蟲死亡率已達100%,而40℃下至15d仍有部分試蟲未死亡。

圖7 不同溫度下接種LA東亞飛蝗的累計死亡率

3 討論

在適宜的溫度范圍內,綠僵菌LA孢子萌發速率快,致病力強,相反,如果環境溫度過高或過低,超出了其適合生長侵染的溫度,致病力便會大大降低。

本研究結果顯示,30℃是LA孢子萌發的最適溫度,在此溫度下菌株LA對蝗蟲的致死速率最快,38℃下培養48h,孢子的萌發率只有10%左右,40℃下培養孢子的萌發率趨近于0,說明該菌株孢子萌發受溫度影響較大。蝗蟲適宜發育的溫度在25～40℃之間,最適宜溫度范圍為28～34℃[5],在有體溫調節或太陽輻射條件下,蟲體溫度可以達到42℃,此溫度限制了LA孢子的萌發,這也是在田間應用綠僵菌治蝗后如遇晴天高溫,其防效不好的主要原因。

綠僵菌的致死溫度(10min內殺死孢子的速度)介于49～60℃之間[6],菌絲體生長的上限溫度約在37～40℃[7-8]。經高溫處理的孢子,移至適合溫度下培養,萌發速率和萌發率均有所降低,說明孢子萌發及存活情況與所達到的高溫程度和該溫度處理的時間有關。本試驗最高處理溫度為48℃,該溫度下導致絕大部分孢子失去萌發能力,恢復至30℃培養萌發率24h僅為20%左右。

馮明光[9]研究認為胞外蛋白酶活性可作為球孢白僵菌大量菌株初篩的參考性毒力指標,但應謹慎使用,不能完全取代常規的毒力測定。林海萍等[10]對15個球孢白僵菌菌株進行了酶活力和毒力測定,認為這些菌株的蛋白酶、幾丁質酶、脂肪酶活性與對松墨天牛毒力間呈極顯著正相關。本試驗選用LA菌株蛋白酶和幾丁質酶活力最高的培養時間,進行了不同溫度下的酶活力測定,結合對應溫度下對東亞飛蝗毒力的測定,結果表明,在菌株的極限高溫和極限低溫時菌株的胞外蛋白酶產量明顯減少,其相應的LT50也較大;而在菌株的最適生長溫度時,其相應的LT50值較小,說明胞外蛋白酶產生水平與毒力之間存在一定的協同性,即產酶水平越高,菌株對東亞飛蝗的毒力就越大,因此可以認為綠僵菌的胞外蛋白酶合成能力是其毒力的決定因素之一。Kucera[11]和St.Leger等[12]也指出綠僵菌的蛋白酶活性與其毒力密切相關。但幾丁質酶活力表達最高的溫度與LA毒力最強的溫度不一致,因此幾丁質酶活力不能作為毒力表達的指標。

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