中藥植物金線吊烏龜對植物病原真菌的抗菌活性

玉艷珍, 鄧業成, 張 明, 覃 旭, 李麗芬, 駱海玉

(廣西師范大學生命科學學院,藥用資源化學與藥物分子工程教育部重點實驗室,桂林 541004)

金線吊烏龜(Stephania cepharantha Hayata)為防己科千金藤屬植物,分布于我國的大部分地區,生長在村邊、曠野、林緣等處土層深厚的地方,也可生長在石灰巖地區的石縫或石礫中。金線吊烏龜的塊根為民間常用草藥,稱白藥、白藥子或白大藥,味苦性寒,有清熱解毒、消腫止痛之功效,常用于治療癰疽腫毒、腮腺炎、毒蛇咬傷等。塊根含多種生物堿[1],藥理學試驗表明,它們具有多種臨床藥理活性,如增強免疫調節,促進血管舒張,抗HIV-1,抗癌,抗過敏等[2-5]。金線吊烏龜還有殺蟲活性,平新亮[6-7]和劉艷華[8]等報道了其對白紋伊蚊、菜青蟲和蘿卜蚜的生物活性。目前為止,其抗菌活性未見報道。本文以農業重要植物病原真菌為供試菌,對金線吊烏龜的抗菌活性及活性成分進行了初步研究,以期為金線吊烏龜在農業領域的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

金線吊烏龜(Stephania cepharantha Hayata)塊根采自桂北地區。

1.1.2 供試植物病原真菌

柿角斑病菌(Cercospora kaki Ell.et Ev.)、梨銹病菌(Gymnosporangium haraeanum Syd.)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav.)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani Kühn)、玉米炭疽病菌[Colletotrichum graminicola(Ces.)Wilson.]、甘蔗鳳梨病菌[Thielaviopsisparadoxa(de Seynes)V.Hohnel]、西瓜枯萎病菌[Fusarium oxysporum f.sp.niveum(E.F.Smith)Syn.et Hans]、柑橘瘡痂病菌(Sphaceloma f awcettii Jenkins)。上述病原真菌通過從田間采集植物發病部位,在室內用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PDA)分離純化獲得。

1.1.3 供試對照藥劑

96%多菌靈原粉：江蘇新沂市經緯化工有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取物的制備

參照陽振等[9]的方法,采用有機溶劑冷浸提取法對金線吊烏龜的塊根進行提取。將采集的植物材料洗凈泥土和雜質,放在室內通風處晾干,再在60℃的恒溫鼓風干燥箱中烘干至發脆,用植物粉碎機粉碎,過40目篩。稱取一定量的植物干粉,放入1 000 mL三角瓶中,加入5倍量甲醇,在室溫下浸提(其間每隔12 h振蕩一次)24 h后傾出上層浸提液,再往三角瓶中加5倍量甲醇繼續浸提24 h,2次浸提液合并,抽濾,濾液用旋轉蒸發儀在水浴中減壓濃縮,蒸干溶劑,得膏狀植物粗提物,密封,放置于4℃冰箱中保存備用。

1.2.2 對病原真菌菌絲生長的抑制活性測定

參照陳年春[10]的菌絲生長速率法進行測定。將供試菌接種在PDA平板培養基上擴大培養,備用。用V(丙酮)∶V(無菌水)=1∶1將樣品配成一定濃度的藥液備用。無菌條件下,吸取1 mL藥液(對照組用V(丙酮)∶V(無菌水)=1∶1代替)與熱熔的9 mL PDA培養基混勻,倒入直徑9 cm的培養皿中,制成厚薄均勻的帶藥培養基。用直徑為0.4 cm的打孔器在已擴大培養的供試菌落邊緣切取菌餅,將菌餅接入帶藥培養基上,使有菌絲的一面朝下,每皿接3個菌餅,呈品字形分布,每個處理設3個重復,置(27±1)℃的恒溫培養箱中培養。用十字交叉法測量培養72 h(水稻紋枯病菌測量48 h)后的菌落直徑,根據下式求出抑菌率：

菌落直徑(cm)=測量直徑(cm)-0.4 cm;

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

測定有效中濃度時,用丙酮和水組成的混合溶劑配制5個以上系列濃度的藥液,測定各個濃度的抑菌率,用最小二乘法求出毒力回歸方程、有效中濃度EC50等。

1.2.3 對病原真菌孢子萌發的抑制活性測定

參照慕立義[11]的孢子萌發法。用少量丙酮將樣品溶解,再用無菌水配成一定濃度的藥液,備用。往事先培養好的供試菌中加適量無菌水,用涂布棒在菌落表面摩擦,使孢子脫落懸浮于無菌水中,用雙層紗布過濾后,配成孢子懸浮液(孢子密度為低倍鏡下每視野80個左右),備用。取9 cm直徑的培養皿,在皿蓋內鋪上一層濾紙,并以水濕透,再將U型玻棒置于皿中央。將孢子懸浮液與藥液等量混合,用滴管加一滴混合液于干凈的載玻片表面(載玻片事先用0.25%火棉膠乙醚溶液處理過),然后將載玻片反放到U型玻棒上,使液滴向下,形成“懸滴”。將皿底扣上,置于(27±1)℃培養箱中培養。每個處理設3個重復。將處理過的孢子培養一定時間后,檢查并記錄孢子萌發的情況(每個處理在低倍鏡下隨機檢查200個孢子),按下式計算孢子萌發抑制率。

萌發率=孢子萌發數/檢查孢子總數×100%;

1.2.4 活性物質的初步分離

按照以下程序(圖 1)對活性成分進行初步分離,將塊根提取物分離成3部分,即非生物堿、氯仿層生物堿和正丁醇層生物堿。

圖1 金線吊烏龜抑制病原菌活性成分的初步分離程序

2 結果與分析

2.1 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

采用菌絲生長速率法測定了金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性,結果見表1。結果表明,金線吊烏龜提取物對梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌有很高的抑制活性,質量濃度為10 g/L時,抑菌率分別為97.74%、100.00%、94.51%和84.40%,對柿角斑病菌的活性較低,抑菌率只有67.59%。廣譜殺菌劑多菌靈在質量濃度為1 g/L時,對柿角斑病菌、水稻紋枯病菌以及玉米炭疽病菌的抑菌率均為100.00%,但對梨銹病菌和稻瘟病菌的抑制活性低,抑菌率分別只有10.27%和23.94%。

表1 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

2.2 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的毒力

為進一步明確金線吊烏龜塊根的抗菌效果,測定了其甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的毒力,結果見表2。由表2可知,金線吊烏龜塊根甲醇提取物對柿角斑病菌、梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌的EC50分別為1.349 1、0.587 9、0.312 2、0.280 7 g/L 和0.835 3 g/L;對照藥劑多菌靈對柿角斑病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌的EC50分別為8.717 1×10-5、7.544 7×10-4g/L和 8.738 4×10-5g/L,對3種病原真菌的毒力遠遠高于金線吊烏龜。

表2 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的毒力

2.3 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對4種植物病原真菌孢子萌發的抑制活性

在實驗室條件下,采用孢子萌發法測定了金線吊烏龜塊根甲醇提取物對4種植物病原真菌孢子萌發的抑制活性,結果見表3。在質量濃度為10 g/L時,金線吊烏龜甲醇提取物能很好地抑制甘蔗鳳梨病菌孢子、柑橘瘡痂病菌孢子和梨銹病菌孢子的萌發,對以上3種病原真菌孢子萌發的抑制率分別為91.80%、97.00%和100.00%。金線吊烏龜對西瓜枯萎病菌孢子萌發的抑制效果比較差,抑制率僅為20.63%。

表3 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對4種病原真菌孢子萌發的抑制活性1)

2.4 金線吊烏龜塊根甲醇提取物粗分各部分的抗菌活性

對金線吊烏龜塊根甲醇提取物進行了初步分離,將其分成非生物堿、氯仿層生物堿和正丁醇層生物堿3部分,各部分的百分含量分別為14.12%、13.53%和11.76%。

采用菌絲生長速率法測定了非生物堿、氯仿層生物堿和正丁醇層生物堿3部分的抗菌活性,結果見表4。當處理濃度為2 g/L時,氯仿層生物堿對柿角斑病菌、梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌的抑菌率分別為51.53%、85.65%、72.93%、75.22%和61.97%,抑菌率均高于正丁醇層生物堿和非生物堿部分,說明金線吊烏龜的抗菌活性成分主要是氯仿層生物堿。

表4 金線吊烏龜粗分各部分對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性1)

3 結論與討論

經活性測定發現,金線吊烏龜塊根甲醇提取物對梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌這4種植物病原真菌菌絲生長具有顯著的抑制活性,但對柿角斑病菌的活性較低;同時,金線吊烏龜提取物對甘蔗鳳梨病菌孢子、柑橘瘡痂病菌孢子和梨銹病菌孢子的萌發具有顯著的抑制效果。由此可見,金線吊烏龜不僅具有抗菌廣譜性,且可能具有多種抗菌作用方式。金線吊烏龜的塊根含多種生物堿,經初步分離,并結合生物活性追蹤,發現金線吊烏龜的抗菌活性成分主要是存在于氯仿層的生物堿,可采用色譜、光譜技術對其中的活性化合物做進一步的分離、純化和鑒定,為新農藥的創制提供先導化合物,這對新農藥的創制具有重要意義。以前的化學殺菌劑因其作用位點單一而使病原菌容易產生抗性[12],而金線吊烏龜有可能具有多種抗菌作用方式,因此進一步探究其作用機理可為開發具有多作用位點的植物源殺菌劑提供重要的理論依據,豐富植物源天然產物農藥的理論基礎。需要指出的是,試驗結果顯示金線吊烏龜的粗提物抗菌活性遠遠低于化學農藥多菌靈,這也是植物農藥難以替代化學農藥的重要原因。通過對活性成分的結構改造,有可能提高活性。

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