嗅三針對血管性癡呆大鼠學習記憶功能及海馬ET和CGRP含量的影響

楊曉航 ，劉智斌 *，牛文民 ，王 淵

（1.陜西中醫學院醫學技術系，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫學院針灸推拿系，陜西 咸陽 712046）

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是由腦血管疾病因素導致腦組織損害而引起的癡呆綜合征，是唯一可以有效預防和治療的老年期癡呆病。眾多研究資料表明，腦組織血管舒縮因素平衡失調是VD的重要病理機制[1]。筆者依據多年來治療VD的經驗[2-3]，選擇VD大鼠作為實驗對象，研究嗅三針（兩側“迎香”及“印堂”穴）對VD大鼠學習記憶能力及海馬內皮素（endothelin，ET）和降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）含量的影響。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年Sprague Dawley雄性大鼠40只，體質量（300±10）g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供（動物編號：0001450）。

1.1.2 儀器 SDQ-30雙極射頻電凝器（上海手術器械廠出品）；Morris水迷宮實驗系統 （北京現代太極電子有限公司出品）；SN-695B型放射免疫測量儀 （上海核儀器一廠出品）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 VD大鼠動物模型 按照經典的四血管阻斷（4-Vesselocclusion,4-VO）方法制作血管性癡呆模型[4]。用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g體質量）腹腔注射麻醉大鼠，常規無菌操作。頸部背側后正中切口，暴露第一頸椎橫突孔，電凝燒灼雙側椎動脈，造成永久性閉塞。24 h后，頸部腹側前正中切口，分離雙側頸總動脈，用微動脈夾可逆性夾閉雙側頸總動脈5 min,共夾閉3次，每次間隔1 h。手術部位施以適量青霉素抗感染，仔細縫合，常規飼養。VD嗅球損毀大鼠動物模型 參照陳志蓉報道的損毀大鼠嗅球的方法[5]，將VD造模成功的大鼠用水合氯醛麻醉后，固定在立體定位儀上。在大鼠顱頂正中切開皮膚，小范圍分離暴露前囟。在大鼠顱頂正中線位于前囟前面5 mm兩側旁開2 mm處，分別鉆2個直徑為1 mm的小孔。將HS-80型電烙鐵的烙頭插入顱內，電凝損毀雙側嗅球。

1.2.2 動物分組 隨機分為4組，即正常組、VD模型組（大鼠造VD動物模型）、VD嗅球損毀模型組 （大鼠造VD動物模型及嗅球損毀并行嗅三針治療）、嗅三針組（大鼠造VD動物模型并行嗅三針治療），每組10只。

1.2.3 嗅三針的定位與操作 嗅三針穴定位為兩側迎香及印堂穴。依據李忠仁教授主編的《實驗針灸學》動物選穴標準[6]，“迎香”穴：大鼠鼻孔外側上端，有毛與無毛交界處；“印堂”穴：大鼠兩眼眶上緣中點連線與正中線交點。操作：選用“華佗牌”不銹鋼針，30號0.5寸毫針。迎香穴向內上方斜刺0.3 cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3 cm。G6805電針儀，上海醫療儀器廠出品；刺激參數：疏密波，刺激強度以保持針刺局部輕微抖動為度 （電流強度：1～3 mA，電壓：1～3 V）。 留針 10 min，持續電刺激，每日 1次。5 d為1個療程，休息2 d，共進行6個療程。從VD模型組和VD嗅球損毀模型組造模完成當日起，正常組和VD模型組每日1次采取與嗅三針治療相同的捉拿固定，但不實施針刺干預，正常飲食飼養42 d；VD嗅球損毀模型組及嗅三針組均采用嗅三針治療42 d。

1.2.4 Morris水迷宮定位航行試驗[7]治療結束后第1天，開始水迷宮測試。水迷宮內水深41 cm，水溫22～26℃。在水池壁標明4個入水點，由此將水池等分為4個象限，任選一象限正中放置平臺，沒于水下1 cm，水面覆蓋塑料泡沫。將受試大鼠按順時針方向依次由E、S、W、N 4個入水點順序面向池壁放入水中。記錄2 min內尋找平臺的時間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2 min內找到平臺，記錄其實際逃避潛伏期及游泳路程；如果大鼠在2 min內未找到平臺，由測試者將其引上平臺并停留10 s,逃避潛伏期記錄為2 min。歷時3 d,每日1次。用3 d找到平臺的平均逃避潛伏期和平均游泳路程評價動物的學習記憶能力。

1.2.5 海馬ET和CGRP含量測定 水迷宮實驗3 d結束后，各組大鼠斷頭后快速取出全腦，在冰盒上分離海馬。用冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干附著的液體后，稱質量后加入0.1 mol/L HAC 2mL，100℃水浴中煮沸10 min。充分勻漿后倒入塑料指形管中，4℃離心 （3 000 r/min，20 min），取上清液置于-20℃冰箱內保存待檢測。海馬ET和CGRP含量測定采用放射免疫法，試劑盒購自南京建成生物工程研究院，按照藥盒說明書操作。

1.3 統計學分析

采用SPSS 11.0軟件對數據進行處理。實驗數據均用“±s”表示，采用單因素方差分析、組間均值進行t檢驗。

2 結果

2.1 嗅三針對大鼠Morris水迷宮定位航行的影響

各組大鼠嗅三針治療后，與正常對照組比較，VD模型組3 d平均逃避潛伏期和平均游泳路程均延長，差異有統計學意義（P<0.01）；與VD模型組比較，嗅三針組3 d平均逃避潛伏期和平均游泳路程均縮短，差異有統計學意義（P<0.01）；與VD模型組比較，嗅三針對VD嗅球損毀模型3 d平均逃避潛伏期和平均游泳路程無影響，差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 嗅三針對大鼠Morris水迷宮定位航行的影響 （n=10，±s）

表1 嗅三針對大鼠Morris水迷宮定位航行的影響 （n=10，±s）

注：與正常對照組比較▲P<0.01；與VD模型組比較*P>0.05，**P<0.01；與VD嗅球損毀模型組比較△P<0.01。下同。

組 別正常對照組VD模型組VD嗅球損毀模型組嗅三針組平均逃避潛伏期（s）平均游泳路程（cm）14.56±7.15 102.56±17.12 112.68±14.53▲ 155.68±16.53▲121.18±15.12* 163.15±15.11*64.16±12.18**△ 114.16±12.28**△

2.2 嗅三針對大鼠海馬ET和CGRP含量的影響

與正常對照組比較，VD模型組海馬ET含量增高，差異有統計學意義（P<0.05）；與VD模型組及VD嗅球損毀模型組比較，嗅三針組海馬ET含量降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與正常對照組比較，VD模型組海馬CGRP含量降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與VD模型組及VD嗅球損毀模型組比較，嗅三針組海馬CGRP含量增高，差異有統計學意義（P<0.05）；VD模型組與VD嗅球損毀模型組比較，嗅三針對海馬ET、CGRP含量均無影響，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表2。

3 討論

血管性癡呆（Vascular Dementia,VD）屬于中醫學“善忘”、“呆病”、“癡證”等范疇。依據現代醫學理論，VD是由于心腦血管病變，因缺血性或出血性腦組織損害所導致的認知功能障礙，是老年癡呆的常見類型。研究結果表明，腦組織血管舒縮因素平衡失調是VD的重要病理機制[1]。

表2 嗅三針對大鼠海馬ET和CGRP含量的影響 （n=10，±s）

表2 嗅三針對大鼠海馬ET和CGRP含量的影響 （n=10，±s）

組 別正常對照組VD模型組VD嗅球損毀模型組嗅三針組ET（pg/mg）CGRP（pg/mg）18.72±4.72 785.36±46.96 32.11±5.78▲ 668.48±41.33▲35.15±4.56* 683.85±42.16*24.36±2.62**△ 732.12±47.12**△

ET和CGRP是機體內最強的縮血管和舒血管多肽，對腦組織血液循環發揮重要的調節作用。相關研究表明，VD患者的腦組織中ET含量增高、同時CGRP含量降低。ET可引發過氧化反應、促進興奮性氨基酸釋放，從而加劇腦組織缺血性損害。相反地，CGRP卻具有增加腦血流量和神經保護的雙重作用[8-9]。本研究結果顯示，嗅三針能夠明顯增強VD模型大鼠學習記憶能力，并且能降低VD模型大鼠海馬ET含量同時提高CGRP含量。然而，對于VD損毀嗅球模型大鼠，嗅三針未能增強其學習記憶能力也沒有明顯影響海馬ET和CGRP的含量。這表明嗅三針對于VD大鼠的療效是通過嗅覺傳導路對中樞神經系統產生作用的，這與筆者前期的研究結果相一致[2]。

本研究證實了嗅三針對VD的治療作用是確切的，其作用機制與調節海馬ET和CGRP含量密切相關，其療效的發揮有賴于嗅覺傳導路的完整性。

[1]胡 蓉，嚴 潔，李鐵浪.電針不同穴位對腦缺血大鼠血漿和腦組織內皮素、降鈣素基因相關肽含量的影響[J].針刺研究，2008，33（3）：169-172.

[2]劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針治療血管性癡呆的隨機對照研究[J].針刺研究，2008，33（2）：131-134.

[3]劉智斌，牛文民，楊曉航，等.頭部發際區排針法治療血管性癡呆療效觀察[J].中國針灸，2007，27（6）：412-414

[4]賴新生，王 黎，江雪華.電針對實驗性血管性癡呆大鼠學習記憶及 SOD 和 MDA 的影響[J].中國針灸，2000，20（8）：497-500.

[5]陳志蓉.貫葉連翹提取物對大鼠雙側嗅球損毀模型的行為學影響[J].中國藥學雜志，2004，39（9）：663-666.

[6]李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫藥出版社，2004：327-329.

[7]Morris R G.Place navigation impared in rats with hippocampal lessens[J].Nature,1982，297（5 868）：681-682.

[8]Yanagisawa M,Kuceihara H,Kinura S1A novel potent vasoconstrictor peptide by vascular endothelial cells[J].Nature,1988，332（6 163）：411-415.

[9]花 放，方秀斌，張 璐.降鈣素基因相關肽對大鼠全腦缺血再灌注腦組織的保護作用[J].卒中與神經疾病，2002，9（6）：331-334.