局灶性腦缺血預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦紅蛋白的表達(dá)及意義

劉勁睿,陳梓桂,張明石

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)2007級(jí)研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

近年來(lái)研究表明[1],缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙,這種恢復(fù)血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷(IRI),抑制再灌注損傷成為目前治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。缺血預(yù)處理(IP)這一概念是由 Murry[2]在1986年研究犬心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中首次提出的,近年研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理可以提高組織對(duì)缺血損傷的耐受性。本研究采用大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈二次線栓法制備 SD大鼠的預(yù)缺血一再灌注一缺血一再灌注在體模型,利用 T TC染色 ,HE染色 ,免疫組織化學(xué)技術(shù) ,觀測(cè)大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間段的大腦皮質(zhì)腦紅蛋白變化,旨在探討腦損傷后大腦皮質(zhì)腦紅蛋白隨時(shí)間變化的規(guī)律,以期完善腦缺血耐受機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年 SD大鼠90只,雌雄不限,2～ 3月齡,體重 230～250g,由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組),缺血再灌注組 (B組),預(yù)處理缺血再灌注組(C組),每組取缺血再灌注 2h、8h、 24h、 48h、 96h5個(gè)時(shí)間點(diǎn) ,分成 5個(gè)亞組,每個(gè)亞組6只老鼠,共90只大鼠。

1.2 動(dòng)物模型制備

本研究參照 Longa等[3]和郝玉曼等[4]線栓法改進(jìn)而來(lái)的大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈二次線栓法制備的 SD大鼠的預(yù)缺血一再灌注一缺血一再灌注在體模型,具體操作如下:SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉后,頸部正中切口,暴露頸總動(dòng)脈(CCA)及分叉部,注意勿傷迷走神經(jīng) ,逐步分離頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),在頸外動(dòng)脈近端備線,在頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈下方各穿一提拉線以暫時(shí)阻斷血流,在頸外動(dòng)脈結(jié)扎線近端距分叉5mm處以頭皮針穿刺的方式導(dǎo)入直徑0.235mm、長(zhǎng)5cm尼龍絲線,插入端用火燒圓并涂以肝素后,進(jìn)入 ICA約18～ 20mm,感覺(jué)有阻力時(shí)則為阻斷 M CA入口,結(jié)扎 ECA近心端,去掉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈下方的提拉線。10min后從 ECA輕輕抽出尼龍絲線約18～ 20mm,形成第一次再灌注 ,將線尾埋在皮下;縫合皮膚切口,完成腦缺血預(yù)處理。72h后將埋在皮下的尼龍絲線再次推入 ICA約 18～ 20mm造成 M CA阻塞(MCAO),90min后將留在皮外的尼龍絲線抽出約18～ 20mm,形成第2次再灌注。各組分別在第2次再灌注后2h,8h,24h,48h,96h評(píng)估神經(jīng)功能缺損,并在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠取出全腦測(cè)定腦組織 N GB含量。假手術(shù)組僅暴露頸總動(dòng)脈及分叉處,不插線阻斷M CA。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),由不了解分組情況的觀察者根據(jù) David-Petullo的行為學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分完畢后,在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)將大鼠斷頭處死,取腦組織甲醛固定,將固定后的腦組織制成石蠟塊連續(xù)冠狀切片,分別進(jìn)行 HE、TTC和免疫組織學(xué)染色。將不同方法染色的切片經(jīng)脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。

1.4 圖像分析

每個(gè)腦組織標(biāo)本選取5張切片進(jìn)行圖像分析,在經(jīng)200倍放大的光學(xué)顯微鏡下,取缺血側(cè)扣帶回皮層區(qū)域進(jìn)行拍照,用 Image一 J軟件數(shù)出每張照片中 NGB陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以表示,用 SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)測(cè)試

神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分:B組和 C組大鼠腦缺血再灌注后2h存在神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)功能明顯缺失,再灌注后不同時(shí)間點(diǎn) B組評(píng)分高于 C組 (P＜0.05),B組和 C組評(píng)分均高于A組 (P＜0.05)。前庭運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分與神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分情況有所相似。

2.2 免疫組化結(jié)果

在腦缺血再灌注后2h,NB在皮質(zhì)區(qū)即有大量表達(dá),24h達(dá)到高峰后數(shù)量逐漸下降,再灌注后2h,8h,24h,48hB組和C組 NB表達(dá)數(shù)量均高于 A組 (P＜0.05)。B組和 C組在再灌注后各時(shí)間點(diǎn) Ngb表達(dá)數(shù)量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.05)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn) NGB的表達(dá)結(jié)果 ±s,n=30)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn) NGB的表達(dá)結(jié)果 ±s,n=30)

2.3 腦組織病理改變

B組在缺血再灌注后2h缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū)神經(jīng)組織細(xì)胞排列開(kāi)始出現(xiàn)紊亂、腫脹,各時(shí)間點(diǎn)腦組織均見(jiàn)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊,24h后出現(xiàn)不同程度的核深染,核固縮,核溶解,間質(zhì)水腫 ,血管周圍間隙增寬,組織壞死嚴(yán)重。C組神經(jīng)組織細(xì)胞的核固縮、核溶解程度比缺血再灌注組明顯減輕,間質(zhì)水腫和血管周圍間隙增寬情況較減少。

2.4 腦梗死體積測(cè)定

在再灌注后相同時(shí)間點(diǎn),C組較 B組梗死體積明顯減小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。

3 討論

近年的研究表明,預(yù)先短暫缺血或輕度低氧可激發(fā)或動(dòng)員機(jī)體內(nèi)在防護(hù)能力,對(duì)隨后的嚴(yán)重缺血或缺氧產(chǎn)生強(qiáng)大防御和保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到,在再灌注后相同時(shí)間點(diǎn),C組較 B組梗死體積明顯減小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。腦缺血預(yù)處理能減少神經(jīng)功能缺損評(píng)分和縮小缺血后腦組織梗死體積比,病理形態(tài)學(xué) HE染色檢測(cè)也顯示腦缺血預(yù)處理對(duì)腦再次嚴(yán)重缺血損傷有明顯的保護(hù)作用。Burmester[5]于 2000年報(bào)道了人和小鼠的腦紅蛋白,為氧這一基本生命元素與神經(jīng)系統(tǒng)功能活動(dòng)之間的關(guān)系提供了重要線索。2002年鄧美玉等[6]發(fā)現(xiàn)大鼠大腦皮質(zhì)中 N GBmRN A陽(yáng)性神經(jīng)元分布廣泛,NGBmRN A產(chǎn)物定位于神經(jīng)元的胞質(zhì)。2004年 Laufs等[7]發(fā)現(xiàn) ,NGB在神經(jīng)元內(nèi)特異性表達(dá) ,而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞卻不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究了大鼠腦缺血再灌注后2～96h后在各組大鼠皮層 NGB陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)變化情況。觀察發(fā)現(xiàn),在腦缺血再灌注后2h,NB在皮質(zhì)區(qū)即有大量表達(dá),24h達(dá)到高峰后數(shù)量逐漸下降。綜上所述腦缺血預(yù)處理有助于腦紅蛋白的表達(dá),腦紅蛋白表達(dá)升高可能對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,可能是局灶性腦缺血耐受產(chǎn)生的分子機(jī)制之一。所以腦缺血預(yù)處理與 NGB二者結(jié)合起來(lái)對(duì)臨床腦缺氧缺血性疾病治療提供了新的思路,對(duì)缺血性腦血管病新藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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