靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠大腦皮質及海馬區 PCNA變化的影響

呂艷婷,王淑秋,宋立德

(1.浙江省諸暨市人民醫院病理科,浙江諸暨 311800;2.佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)

癲癇(Epilepsy EP)是一組由大腦神經元高度同步化異常放電所引起的短暫中樞神經系統功能失常為特征的慢性腦部疾病,具有突然發生、反復發作,可自然緩解的特點[1]。癲癇的病因 ,發病機制,演變過程十分復雜,迄今尚未完全明確。目前,針對癲癇發病機制的研究表明,作為神經系統重要組成成分的神經膠質細胞(AS)在中樞神經系統病變中扮演重要角色,幾乎所有的癲癇病例手術切除標本及動物實驗模型中均可見到神經膠質細胞的增生。 AS是中樞神經系統中主要的大膠質細胞,對神經元的營養,支持,修復,再生起到重要作用,同時對有害刺激產生強烈反應,因此,AS的反復增殖活化與癲癇的發生演變的密切相關性越發受到重視。我國藥用植物資源豐富,靈芝孢子粉作為一種名貴中草藥,含有豐富的營養物質,如氨基酸及微量元素等,能有效調節機體免疫力 ,清除氧自由基,增加耐低氧能力,降脂,保肝 ,抗衰老,抗腫瘤,并能穩定膜離子通道,減輕鈣超載,而且對神經系統還具有鎮靜和保護功能,降低受損傷神經元的死亡率[2～6]。本實驗通過對 PCNA的檢測,探討靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠中樞神經系統星形膠質細胞增殖活化的影響,進一步研究癲癇發病機制及靈芝孢子粉作用機制,為尋找合理有效抗癲癇藥物提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性 Wistar大鼠 30只,體重(200±20)g,購自佳木斯大學實驗動物中心,隨機分為對照組、癲癇模型組和靈芝孢子粉干預組,每組各 10只。

1.2 模型制備

癲癇模型組和靈芝孢子粉干預組用亞驚厥劑量的 PTZ(35mg/kg體重)腹腔注射,注射時濃度為 10g/L,每日 1次,持續 28d,同時對照組以等容生理鹽水腹腔注射;靈芝孢子粉干預組經灌胃給予靈芝孢子粉(150mg/kg體重),灌胃時濃度為30g/L;同時癲癇模型組和對照組以等容生理鹽水灌胃。

1.3 行為學觀察

每天對每只大鼠在 PTZ注射后進行觀察并記錄癲癇發作的潛伏期 ,發作級別及持續時間,用藥 28d后停藥一周 ,再用相同劑量的 PTZ測試,凡出現連續 5次Ⅱ級以上癇性發作為達到點燃標準。

1.4 免疫組織化學

實驗動物麻醉后斷頭處死,在低溫條件下迅速取腦,中性甲醛固定包埋,用切片機在視交叉后 2mm,按 5 μm每層進行冠狀切片,制片后備用。 0.3%H2O2室溫孵育15min,以消除內源性過氧化物酶的活性;抗原修復;山羊血清封閉;依次加一抗 (兔抗大鼠 PCNA多克隆抗體 ,1:100,北京博奧森生物技術有限公司),37℃水浴箱孵育 90min;AP標記的生物素化山羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司),37℃孵育 20min;試劑 SABC37℃孵育 20min。 DAB顯色 (2～ 5min,PCNA陽性反應產物為棕黃色,位于胞核),脫水,透明,封片。光鏡下觀察。

1.5 Western-blot

動物分組與模型制備同步驟一、二,冰上迅速分離海馬,冰上勻漿 10min,加入裂解液裂解 30min,4℃下 12000rpm離心 15min,取上清備用。蛋白定量測定后 ,蛋白樣品采用 10%的 SDS-PAGE進行電泳分離,然后轉至 PV DF膜作免疫反應。浸入封閉液 4℃過夜,然后依次加入適宜濃度的兔抗大鼠PCNA多克隆抗體,37℃孵育 2h,適宜濃度的生物素化的山羊抗兔 Ig G抗體 37℃孵育 1h,BCIP-NBT顯色(1:50,武漢博士德生物工程有限公司)。各反應間用緩沖液充分洗滌。拍攝濾膜圖片留作永久性實驗記錄,用凝膠圖象處理系統分析目的條帶的分子量和凈光密度值。

1.6 圖像分析及統計學處理

每只實驗動物標本隨機選擇 4個切面,每張切片隨機選擇5個400倍視野(共20個視野 /只 ),記錄每 400倍視野陽性細胞數用 BI-2000醫學圖像分析系統分析 PCNA免疫反應性,Western-blot結果用 GIS凝膠圖像處理系統分析 ,實驗中所得計量資料數據結果均以(平均數±標準差)表示 ,多組之間的比較用方差分析,顯著性水準為 0.05,使用 SPSS for Windows 11.5統計軟件包進行統計。

2 結果

2.1 行為學觀察

對照組無癇樣發作,癲癇模型組有重度的癇樣發作(Ⅳ～Ⅴ級),靈芝孢子粉干預組有輕度的癇樣發作(Ⅰ～Ⅱ級),與癲癇模型組動物相比,靈芝孢子粉干預組大鼠潛伏期明顯延長,發作級別降低,少有大發作。

2.2 PCNA免疫組化結果

癲癇模型組大腦皮質及海馬 PCNA免疫反應陽性細胞數比空白對照組明顯增多,差異具有顯著性 (P＜0.01),靈芝孢子粉組大腦皮質及海馬 PCNA免疫反應陽性細胞數比癲癇模型組明顯減少 ,差異具有顯著性 (P ＜0.01)。(見表1與圖 1,圖 2)。

表1 大腦皮質和海馬區PCNA陽性細胞數的變化(± s,n= 10,個 /400倍視野 )

表1 大腦皮質和海馬區PCNA陽性細胞數的變化(± s,n= 10,個 /400倍視野 )

注:*與空白對照組比較,P＜0.01;#與癲癇模型組比較,P＜0.01。

組 別 皮 質 海 馬空白對照組 10.20± 1.312.23± 0.48癲癇模型組 61.10±3.78* 35.30±2.21*靈芝孢子粉組 21.80±1.93# 8.60±1.07#

2.3 Western-blot檢測海馬區 PCNA蛋白含量

PCNA分子量為 36KD,內參為43KD?？瞻讓φ战M海馬區 PCNA表達量很少,PT Z致癇后大鼠大腦海馬區 PCNA表達量明顯增加,差異有顯著性(P ＜0.01),靈芝孢子粉干預組 PCNA表達量與癲癇模型組相比較明顯減少,差異有顯著性 (P ＜ 0.01)。(見表2,圖 3)。

表2 海馬區 CyclinD1與 PCNA蛋白含量變化 ±s,n=10)

表2 海馬區 CyclinD1與 PCNA蛋白含量變化 ±s,n=10)

注:與空白對照組比較,* P＜0.01;與癲癇模型組比較,#P＜0.01。

空白對照組 0.18±0.050.17±0.01癲癇模型組 0.56± 0.06* 0.59±0.01*靈芝孢子粉組 0.36±0.04# 0.38±0.02#

圖 3 大腦海馬區 PCNA蛋白含量變化

3 討論

AS是中樞神經系統重要的組成部分,其不僅發揮營養支持及協助代謝的功能同時參與 CNS的信息傳遞與整合。PCNA是一種核內蛋白質,是 DN A聚合酶δ的輔助蛋白[7,8],可以與 CDK抑制劑 P21、CyclinD1和 CDK結合形成復合物 ,并能刺激 CyclinD1-CDK復合物對DN A連接酶的磷酸化,從而參與正常的 DN A復制、細胞周期的轉變和受損 DNA的切除修復過程,與細胞的增殖周期密切相關,其表達程度反映了細胞增殖活性的高低,是反映細胞增殖情況應用最普遍的抗原標記。本實驗免疫組化結果顯示,癲癇模型組與空白對照組相比較 PCNA陽性細胞數明顯增多,表明細胞增殖活性增強。而靈芝孢子粉治療組 PCNA陽性細胞數明顯低于癲癇模型組。 Western-blot檢測結果與免疫組化相同,顯示靈芝孢子粉對PTZ致癇模型皮質和海馬膠質細胞的增殖活性有抑制作用。中醫藥治療癲癇歷史悠久,其中靈芝孢子粉具有調節免疫、提高機體耐缺氧能力,穩定膜離子通道,減輕鈣超載,對神經系統也有鎮靜和保護功能,從而激活機體內在的抗損傷機制。綜上所述,靈芝孢子粉具有抑制PTZ致癇大鼠模型 PCNA表達和膠質細胞增殖活性、減輕癇樣發作的程度和抑制癇樣放電的作用,但其具體作用機制仍有待進一步研究。靈芝孢子粉的這些作用可能在防治癲癇的發生發展和復發方面具有重要意義。

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