節段性骨缺損修復過程中幾種微量元素含量的研究

趙益峰,王海濱,孟純陽,賈存嶺,張元民,孔祥清,高峰

(山東濟寧醫學院附屬醫院骨科,山東 濟寧 272000)

長期以來,在動物實驗中對骨折愈合的評價往往主要依靠 X線片和骨痂標本的組織學及組織化學觀察[1]。然而,對骨痂愈合的組織學評分方法本身具有很大的主觀性,且得到的是統計學上的計數資料,帶有一定的局限性,因此需要尋找能定量反映骨折愈合的較為理想、客觀的計量指標[2]。有作者實驗表明[3],骨痂灰度,骨礦物質含量以及骨的生物力學參數之間有著明顯的相關關系,可以對骨折愈合進行綜合評價。本實驗對節段性骨缺損修復過程中骨礦的幾種代表微量元素鈣(Ca)、鋅 (Zn)、鎂(Mg)、銅(Cu)的含量變化作了初步研究,對它們是否可以作為骨折愈合的評價指標提出了初步見解。

1 材料和方法

1.1 兔骨缺損修復材料的制作 7只新西蘭大白兔(雄性,2～ 2.5 kg,濟南農科院畜牧所種兔廠),取長 1.5 cm尺橈骨共 84枚 ,12枚經-80℃深低溫冰箱冷凍、脫水、脫脂、干燥,60CO照射等制成深低溫冷凍骨;另 12枚經同樣上述程序處理后再在 0.6N鹽酸中脫鈣等制成深低溫冷凍脫鈣骨基質;另 60枚制成脫鈣骨基質。

1.2 骨缺損支架材料的構建 A1:指上述所制保持完整管狀的脫鈣骨基質;A2:指 A1一劈為二,1/2旋轉 180°與另一半組合;B1:指 A1復合堿性成纖維細胞生長因子 1000IU(將含 1000 IU堿性成纖維細胞生長因子的水溶液 0.1 mL滴入材料髓腔 2 h);B2:指 A2復合堿性成纖維細胞生長因子1000 IU;C1:指髓腔中注滿宿主兔的自體骨髓的 A1;C2:空白對照組,指實驗兔骨缺損處不植入任何材料;D1:指上述所制的保持完整管狀的深低溫冷凍脫鈣骨基質;D2:指上述所制的保持完整管狀的深低溫冷凍骨。

1.3 骨缺損動物模型制作、修復材料植入及動物實驗設計新西蘭大白兔 40只,按完全隨機設計的方法分配成四組A、B、C、D,每組 10只,在兔雙側橈骨中上段做 1.5 cm長的節段性骨膜骨缺損模型,A組隨機一側前肢植入上述材料A1,另一側植入 A2;以此類推,B、C、D組的一側前肢隨機分別植入材料 B1、 C1、D1,另一側分別植入材料 B2、 C2、 D2。

1.4 實驗檢測 于手術后第 1、2、4、8、12周各組分別隨機殺死 2只實驗兔做如下檢測。

1.4.1 X線檢查 實驗兔空氣栓塞處死后立即進行雙前肢同樣條件下 X線片檢查。

1.4.2 組織學檢測 缺損移植區取材后剔除表面軟組織,材料一半多聚甲醛固定,甲酸脫鈣,叔丁醇透明,常規石蠟包埋、制片,HE染色,普通顯微鏡觀察。

1.4.3 金屬元素含量的測定 取材的另 1/2稱重,勻漿,離心,沉淀物用火焰原子吸收分光光度儀行 Ca、Zn、Mg、Cu等金屬元素的測定。

1.4.4 統計學方法 金屬元素測定結果應用 SPSS10.0軟件進行雙因素方差分析 (采用 Tukey HSD法或 LSD法),P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

實驗期間各組動物均順利完成預期實驗。

2.1 X線檢查 術后 12周除 C2空白對照組骨缺損未愈合外,其余各組均達到完全骨性愈合,各組缺損修復區已基本上接近正常橈骨,髓腔已基本上完全再通,尺橈骨間基本上已相互獨立。

2.2 組織學檢測 術后 12周除 C2空白對照組骨缺損未愈合外,其余各組均達到骨性愈合。板層骨均已轉化成稍欠成熟的皮質骨,髓腔已全部再通,骨髓都已轉化成成熟骨髓。

2.3 金屬元素含量的測定 鈣含量的測定結果見表 1。各時間點之間 Ca含量差異具有統計學意義者(P＜0.05,Tukey HSD法 )見于 a、 b間 ,a、 d間 ,b、 c間 ,c、d間 ,見圖 1。

鋅含量的測定結果見表 2。各時間點間 Zn含量差異具有統計學意義者 (P ＜0.05,LSD法)見于 a、b間,a、c間 ,a、d間 ,a、e間 ,b、e間 ,c、 d間 ,c、 e間 ,見圖 2。

鎂含量的測定結果見表 3。各時間點間 Mg值含量差異具有統計學意義者(P ＜0.05,LSD法)見于 a、b間,a、d間,b、c間 ,d、 c間 ,見圖 3。

銅含量的測定結果見表 4。各時間點間 Cu值含量差異具有統計學意義者(P ＜0.05,LSD法)見于 a、e間,b、e間,c、 e間 ,見圖 4。

表1 各時間點各組標本單位濕重 Ca值(μ g/mg)

表2 各時間點各組標本單位濕重 Zn值(μ g/mg)

表3 各時間點各組標本單位濕重 Mg值(μg/mg)

表4 各時間點各組標本單位濕重 Cu值 (μg/mg)

圖1 各時間點 Ca值變化

3 討 論

圖2 各時間點 Zn值變化

圖3 各時間點 Mg值變化

圖4 各時間點 Cu值變化

同種異體脫鈣骨基質、同種異體深低溫冷凍骨以及自體骨髓均能修復骨缺損,國內外作者已經大量實驗證實,用一定的材料將骨缺損部位與周圍組織間隔,能夠促進骨缺損的修復,此即引導性骨再生理論,也有大量實驗證實。基于以上兩種骨缺損修復理論,本實驗將同種異體的管型脫鈣骨基質、管型深低溫冷凍骨作保留管型及劈裂不保留管型等構建(見上述材料和方法中兔骨缺損修復材料的制作以及骨缺損支架材料的構建),觀察到術后 12周時除 C2空白對照組骨缺損未修復外,其余各組無論從 X線片表現、取材術中所見以及組織學表現均顯示骨缺損已經較好的修復,當然在術后不同時間點各不同修復材料的修復進度仍表現出較大的差別。各種不同條件下骨缺損修復過程中,微量元素 Ca、Zn、Mg、Cu的變化規律及其與骨缺損修復進程的相關性探討如下。

鈣是骨的主要金屬元素之一,骨缺損修復后骨痂的多少,換言之鈣含量的多少可以直接說明骨修復的程度。我們對實驗中不同支架材料在不同時間點所修復的缺損標本全部予以鈣含量測定 ,結果見表 1。從圖 1可以看出,術后 2、8、12周各材料的鈣含量均較術后第 1周有明顯的提高,但術后第 4周鈣含量明顯較第 2周降低,之后又明顯提高,這和有關作者[4]骨痂鈣在整個骨折愈合期均穩定的報道不符。分析原因,可能術后第 4周末各材料正達編織骨期向板層骨期轉化的高峰,此時需要髓腔的整合與貫通,鈣大量分解吸收,造成此期鈣含量下降;之后前期板層骨及板層骨鈣開始大量沉積,致使鈣含量自 4周末開始上升,8周末達高峰,8周末后進入塑形期,少量不在力線上的骨質被吸收,導致 8周末后鈣含量輕度下降,但總的趨勢是材料移植后鈣含量逐漸增加。基于上述原因,鈣作為評價成骨活性大小的指標,取材應有時間限制,應避開編織骨向板層骨轉化的高峰期。

在骨形成和代謝過程中,三種代謝酶類即堿性磷酸酶、膠原酶和碳酸酐酶起著重要作用,鋅是三種酶的重要輔助因子。 Haumont在 1961年就報告鋅主要集中在鈣化前的類骨質中,這與骨中堿性磷酸酶最大含量一致。缺鋅時,主要是堿性磷酸酶的含量受到影響。 Zorrilla等[5]發現血清鋅過低的髖部骨折患者愈合受到影響,血鋅值可以作為髖部骨折患者能否愈合的預測指標。國內學者藍文正等[4]對 72只家兔橈骨進行試驗性骨折,發現鋅在骨折處的代謝高于對側相應部位的水平,且骨鋅在第 4周出現高峰值,表明骨愈合過程中局部鋅代謝是旺盛的。鋅對破骨細胞的形成具有潛在的抑制作用,并與其他抗骨吸收因子如降鈣素、雌二醇相同,抑制作用發生于骨髓細胞分化的晚期。鋅可能是破骨細胞膜質子泵的抑制劑,對骨吸收具有直接的抑制作用。我們對骨缺損修復區內骨組織的鋅含量進行測量,從中試圖得到有益的信息(見表 2)。從統計數據來看,骨鋅在第 2周末就達到第一個高峰值(P＜0.05),一直維持同一水平持續到第 4周末。之后骨鋅值繼續升高,到第 8周末到達第二個峰值(P＜0.05),之后基本上維持在此水平 (見圖 2),這和有關作者[4]的觀察同樣有出入。另外,統計分析還可以看出 ,對不同材料間的骨鋅值進行比較得出一個有趣的現象:越是成骨活性較好的材料其骨鋅均數值越低,越是成骨活性較差的材料其骨鋅均數值越高,這和已知的骨鋅值的作用似乎正好相反,其中的原理有待進一步明確。并且骨鋅值是否可以作為一個評價材料成骨活性的指標(骨鋅值高則材料成骨活性低、骨鋅值低則成骨活性高)還有待于我們進一步探究。

Mg是機體一種必需元素 ,是多種酶的激活因子,可激活多種水解酶、合成酶、激酶和羥化酶,參與三磷酸腺苷的依賴性反應,影響蛋白質、核酸合成。 Ryder等[6]發現白種人較多攝入鎂后其骨礦量明顯增高。翟照等[7]通過對家兔行骨折部位自體骨髓移植,發現實驗側骨痂量明顯多于對照側,同時骨痂中鎂含量亦高于對照側。我們對各種不同支架材料修復骨缺損后不同時間點骨痂中的鎂含量作了測定(見表 3),結合 X線、組織學檢測,以期發現兩者間是否具有某種程度的相關性。從統計數據可以看出,骨缺損區材料移植后第 2周末骨鎂值達高峰(P＜0.05),之后未像骨鋅值那樣維持同一水平至第 4周,而是到第 4周末下降至第一周時的水平(P＜0.05),之后又繼續升高,至第8周末升至第二個峰值(P＜0.05),之后基本上維持這一峰值但也有所下降(P＞0.05)(見圖 3),這種變化和 Ca的變化趨勢極其相似(見圖 1)。另外我們還發現,不同的移植材料其骨鎂值出現的變化與骨鋅值相似,即越是成骨活性較好的材料其骨鎂值越低,越是成骨活性較差的材料其骨鎂值越高,這和有關作者[7]做的實驗結果相反,其原理有待于闡明,且骨鎂值可作為成骨活性檢測指標也有待于明確。基于與鈣相同的原因,其取材時間也應受類似的限制。

Cu是體內必需的微量元素,是骨和酶系統的重要組成部分,是骨愈合中最活躍的因素[4],是某些酶的激活物質,銅借助這類酶對成骨細胞起激活作用。翟照等[7]在家兔自體骨髓移植骨痂銅含量檢測中發現,骨髓移植后 2周實驗側高于對照側,推測可能為銅促進膠原纖維交聯,同時發現這種作用僅限于骨髓移植術后的 2周內 ,術后 6周時骨痂中銅達峰值,兩側無顯著性差異。我們在本實驗中對各時間點各組的缺損區標本均作了銅含量測定(見表 4),并對其進行統計學處理,結果和上述實驗的檢測結果不相同。統計顯示,各組材料移植術后第 1、2、4周骨銅水平很穩定,直到第 4周末才有輕度上升 (P＞0.05),第 8周末后骨銅水平明顯上升,至 12周末達峰值(P＜0.05)(見圖 4)。12周后是否還上升,因我們的實驗最后一批取材在第 12周末 ,結果還不清楚。從本資料來看,銅并非骨缺損修復過程中的活躍元素,它不適于作為成骨活性的檢測指標。

[1]Nunamaker DM.Experimental models of fracture repair[J].Clin Orthop Relat Res,1998,(355 Suppl):56-61.

[2]Markel MD,Chao EY.Noninvasive monitoring techniques for quantitative description of callus mineral content and mechanical properties[J].Clin Orthop Relat Res,1993,(293):37-40.

[3]鮑善芬,趙霖,劉玉杰,等.金屬銅對骨折愈合作用的實驗研究 [J].中華外科雜志,2002,40(7):538-543.

[4]藍文正,劉國棟,沙因,等.骨折愈合過程中微量元素含量的研究 [J].中華骨科雜志,1989,9(4):200-203.

[5]Zorrilla P,Salido JA,L′opez-Alonso A,et al.Serum zinc as a prognostic tool for wound healing in hip hemiarthroplasty[J].Clin Orthop Relat Res,2004,(420):304-308.

[6]Ryder KM,Shorr RI,Bush AJ,et al.Magnesium intake from food and supplements is associated with bone mineral density in healthy older white subjects[J].J Am Geriatri Soci,2005,53(11):1875-1880.

[7]翟照,陳鳳苞.家兔自體骨髓移植對骨痂中鈣鎂銅含量的影響 [J].中國骨傷 ,2002,15(2):82.