MTHFR基因A1298C多態(tài)與缺血性腦血管病的相關(guān)性

陳 芳 封青川 鄭 紅 宋 波 賀 穎 連建華 齊 華 談 頌 許予明

1)河南焦作市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 焦作 454000 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

目前大量臨床和流行病學(xué)研究證實(shí)了同型半胱氨酸(Hcy)代謝異常導(dǎo)致的高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HcyM)是缺血性腦血管病(ischemic cerebravascular disease,ICVD)重要的獨(dú)立危險因素[1-2]。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MT HFR)是Hcy代謝的關(guān)鍵酶,研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)MT HFR部分多肽位點(diǎn)的錯義突變可導(dǎo)致該酶的活性和穩(wěn)定性下降,造成Hcy再甲基化生成甲硫氨酸這一代謝過程障礙,導(dǎo)致HcyM。HcyM 可誘導(dǎo)靜止期細(xì)胞進(jìn)入分裂期,刺激血管平滑肌細(xì)胞增生[3],促進(jìn)氧自由基的生成,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞生長,影響凝血和纖溶系統(tǒng),抑制組織型纖溶酶原激活物的合成,促進(jìn)血小板黏附和聚集,從而增加心腦血管疾病發(fā)病的危險性[4]。目前,M THFR基因被普遍認(rèn)為是研究各類心腦血管疾病遺傳易感性的主要候選基因。A1298C是MT HFR次常見突變,不同研究關(guān)于MTHFR基因多態(tài)A1298C與ICVD的關(guān)系的研究結(jié)論不同,為探討A1298C多態(tài)可否作為ICVD的危險因子和在預(yù)防ICVD的價值,本文應(yīng)用Taqman-MGB探針基因分型技術(shù)調(diào)查A1298C多態(tài)在河南漢族人群健康人與ICVD病人的分布并同其他種族和地區(qū)的人群進(jìn)行比較,探討A1298C在ICVD發(fā)生過程中的作用。

1 對象

入選標(biāo)準(zhǔn):(1)1995年中華醫(yī)學(xué)會第四屆腦血管會議所修定的ICVD診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)頭顱CT及MRI證實(shí)。(2)隨機(jī)原則。(3)排除標(biāo)準(zhǔn):排除低血容量、感染所致的腦梗死和無癥狀性腦梗死,同時排除癲、癌癥以及肝腎功能不全、接受器官移植、嚴(yán)重營養(yǎng)不良等。(4)無血緣關(guān)系。病例組470例,男292例,女178例,年齡(59±11.3)歲,來自 2004-12～2005-07河南省二甲以上醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者。對照組495例,男320例,女175例,年齡(55±10.8)歲,篩選自同期門診體檢的健康老年個體,體格檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查均未見異常,并排除心腦血管病或糖尿病家族史者。本研究人群均為河南漢族人。2組間年齡、性別分配經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 方法

2.1基因組DNA提取采取所有受試者空腹外周血3 mL,采用常規(guī)的苯酚-氯仿方法提取基因組DNA。

2.2試驗(yàn)方法采用病例對照分析方法,用TaqMan-MGB探針PCR方法進(jìn)行基因分型。PCR引物及 MGB探針用Primer Express Oligo Design v2.0(ABI PRISM)軟件設(shè)計(jì)(訂購檢測號:C-850486-20,美國ABI公司),反應(yīng)體系包括一對引物及2個分別檢測不同等位基因的熒光探針,探針的5′端連接FAM(檢測 A 堿基)或 VIC(檢測 C堿基),3′端連接不發(fā)光的粹滅基團(tuán)和一個MGB(minor grove binder)基團(tuán)。PCR 反應(yīng) 體系(5 μ L):2.5 μ L TaqMan? Universal PCR Master Mix,(CattNo:4324018,Applied-biosystems Inc.USA)0.06 μ L 40xC-850486-20 探針 ,1 μ L 10-20 ng/L DNA模板,1.44 μ L MilliQ水。PCR循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性10 min,92℃變性15 s,退火和延伸均為 60℃1 min,進(jìn)入45輪循環(huán)。TaqM an MGB探針熒光標(biāo)記的PCR反應(yīng)在一封閉的管中進(jìn)行,擴(kuò)增反應(yīng)后,目的基因片段被標(biāo)記呈不同的熒光,通過ABI7900熒光檢測儀對不同熒光自動進(jìn)行基因分型分析。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,基因頻率采用計(jì)數(shù)法,經(jīng)χ2檢驗(yàn)檢測2組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡,樣本具有群體代表性。2組間的基因型頻率和等位基因頻率的比較用χ2檢驗(yàn)。ICVD是否發(fā)生與遺傳基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)程度以比值比(odds ratios,OR)及95%(confidence interval,CI)可信區(qū)間表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 A1298C多態(tài)性擴(kuò)增的目的片段標(biāo)記呈不同的熒光,通過ABI7900基因分析儀檢測不同的熒光進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)分析,自動給出分型結(jié)果。VIC探針發(fā)出紅色熒光,報告C等位基因,純合野生型CC顯示為紅色,FAM探針報告發(fā)出藍(lán)色熒光A等位基因,純合突變型AA顯示為藍(lán)色,雜合子1298AC則顯示為綠色(圖1)。

圖1 A1298C基因位點(diǎn)TaqMan-MGB探針單核苷酸多態(tài)分型圖

3.2 M THFR-A1298C基因型及等位基因頻率分布C等位基因在ICVD組和病例組分別為13.1%和11.2%,2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C/C型在ICVD組中7例(1.5%),對照組中3例(0.6%),占全部被檢測者的1.04%。2組間A/C基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

3.3河南漢族A1298C的基因型、等位基因型分布及同中國及國外不同地區(qū)種族人群的比較河南漢族對照組A1298C多態(tài)與毛仁芳等[5]研究的3個不同地域漢族人群及其中部分少數(shù)民族人群數(shù)據(jù)比較:新疆漢族人群1298C等位基因頻率為42%,福建漢族人67%,四川漢族人71%,遼寧滿族人28%,寧夏回族人和云南傣族人48%,河南漢族人群分布頻率為11%。將河南漢族1298C等位基因頻率同以上各地域人群相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將河南漢族人A298C基因三型分布與之相比較,差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。1298C等位基因在意大利和高加索人群的分布頻率均為31%,印第安人 44%,突尼斯人 27%,黎巴嫩人 24%。河南漢族人群A1298C基因三型分布同國外這些人群相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見表3。

表1 ICVD組和對照組A1298C基因型和等位基因頻率分布 [例(%)]

表2 河南漢族A1298C基因型等位基因分布及同其他地區(qū)人群的比較 [例(%)]

表3 河南漢族A1298C基因型等位基因分布及同其他地區(qū)人群的比較 [例(%)]

4 討論

A1298C突變位于M THFR基因第7外顯子C端調(diào)節(jié)區(qū)核苷酸1298位點(diǎn),該位點(diǎn)的腺苷酸突變?yōu)榘奏?導(dǎo)致編碼的谷氨酸被丙氨酸取代。有研究認(rèn)為A1298C純合突變可導(dǎo)致MT HFR的活性降低,被認(rèn)為是HhcyM的遺傳危險因素[8]。體外實(shí)驗(yàn)表明,A1298C發(fā)生突變可使酶活性下降,但并不造成葉酸和Hcy的代謝障礙,而Kumar[8]研究的印度人1298CC型與HhcyM密切相關(guān),這同時與印度人A1298C的高突變率有一定關(guān)系,但該學(xué)者并未提出該突變與印度人中風(fēng)疾病關(guān)系的結(jié)論。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,ICVD組和對照組M THFR基因A1298C多態(tài)各基因型及等位基因頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明河南漢族人群ICVD的發(fā)生與A1298C基因多態(tài)性無關(guān),分析原因在于:(1)河南漢族人群M THFR基因A1298C等位基因突變率極低;(2)ICVD是一種多因素疾病,是遺傳因素與環(huán)境因素、生活習(xí)俗等共同作用的結(jié)果;(3)參與葉酸、同型半胱氨酸代謝的酶、輔酶及調(diào)控基因有多種,調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜。

我們對495例對照組個體進(jìn)行基因分型,并同所收集的文獻(xiàn)中中國及國外不同地域相同或不同種族人群對照組人群或健康研究對象數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),河南漢族人群中1298C等位基因頻率最低,為 11%,純合子僅占 1%,其等位基因頻率和基因三型分布同國內(nèi)部分少數(shù)民族及國外其他種族和地區(qū)人群相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即使同為中國漢族,不同地區(qū)人群之間,亦是如此,這說明 MTHFR基因多態(tài)分布可能受到人種、地域、民族、地理環(huán)境、樣本量大小等多種因素的共同影響,提示這個位點(diǎn)存在基因多態(tài)性的群體和地域變異,同時提示A1298C突變可能與具有地域分布特點(diǎn)的一些疾病有關(guān),有待進(jìn)一步深入研究。

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