電針對(duì)擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)可塑性的影響研究

王 威 唐 偉 孫忠人

1)大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科 大連 116001 2)大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 大連 116001 3)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 哈爾濱 150040

本研究通過建立一個(gè)集衰老、鋁中毒以及膽堿能系統(tǒng)損害等多因素的AD動(dòng)物模型,研究針刺對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)可塑性的影響,以進(jìn)一步探討針刺改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的中樞機(jī)制,為針刺治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠50只,由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)為遼實(shí)動(dòng)質(zhì)字[2000]028號(hào))。自由進(jìn)食,每日照明12 h,室溫(23±2)°C。

1.2藥品及主要試劑JEM-1220型透射電子顯微鏡;LKB-V超薄切片機(jī);跳臺(tái)儀(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院提供);圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0,美國)。

1.3方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理:按照體質(zhì)量將50只大鼠隨機(jī)分成4組:空白對(duì)照組(10只)、空白電針組(10只)、模型組(15只)和模型電針組(15只)。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用相同的飼料喂養(yǎng),整個(gè)喂養(yǎng)過程中所使用的器皿均為非鋁制品。空白對(duì)照組:予常規(guī)飲水和飼料,并胃飼及腹腔注射與模型組等容量的生理鹽水;空白電針組:在給予生理鹽水同時(shí)進(jìn)行電針治療;模型組:SCOP+AlCl3+D-gal;模型電針組:在造模同時(shí)進(jìn)行電針治療。

1.3.2 穴位選擇:百會(huì):頂骨正中;大椎:第七頸椎棘突與第一胸椎間,背部正中;腎俞:第二腰椎下兩旁;足三里(后三里):膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處。

1.3.3 針刺方法:用0.25 mm×15 mm毫針針刺大鼠“百會(huì)”穴,向前斜刺約 3 mm,“大椎”穴,直刺約 4 mm,雙側(cè)“腎俞”穴,直刺進(jìn)針 5 mm,雙側(cè)“足三里”穴,直刺進(jìn)針 5 mm。連接KWD-808Ⅱ型全能脈沖電療儀,疏波,頻率2 Hz,電壓2 V,強(qiáng)度以肢體輕微抖動(dòng)為度。1次/d,時(shí)間20 min。10 d一療程,間歇1 d,治療三個(gè)療程后進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.3.4 大鼠行為學(xué)檢測:跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)[1]:電針治療結(jié)束后進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn);實(shí)驗(yàn)裝置為15 cm×30 cm×30 cm的被動(dòng)條件反射箱,箱底鋪以銅柵,銅絲直徑2 mm,間距5 mm;電流強(qiáng)度由一個(gè)可調(diào)變壓器控制,通以36 V電流,箱內(nèi)右后側(cè)放置一個(gè)高和直徑均為4.5 cm的橡皮墊作為大鼠逃避電擊的安全區(qū)。將大鼠放入箱中自由活動(dòng)3 min,熟悉環(huán)境,然后箱底通以電流,其正常反應(yīng)是跳上平臺(tái)以躲避傷害性刺激;記錄大鼠首次跳到銅柵上的時(shí)間(即潛伏期)和5 min內(nèi)大鼠跳到銅柵上的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù)),以此作為學(xué)習(xí)成績。24 h后重復(fù)試驗(yàn),記錄其第一次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù),從而反映大鼠的記憶保持能力。

測試結(jié)束后,每組隨機(jī)取5只動(dòng)物,經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后,常規(guī)心臟灌注后斷頭剝腦,按照大鼠腦立體定位解剖圖譜取海馬區(qū)固定、丙酮梯度脫水、浸透、包埋、切片(厚600A0),230目銅網(wǎng)撈片、3%檸檬酸鉛+0.1%醋酸鈾雙重電子染色后電鏡下觀察結(jié)果。電鏡觀察首先遵循確認(rèn)突觸的標(biāo)準(zhǔn)固確認(rèn)突觸:(1)可見突觸的前后膜;(2)可見致密帶;(3)突觸前膨大內(nèi)可見3個(gè)以上突觸小泡。然后電鏡下大體觀察,按體視學(xué)禁線法則,進(jìn)行突觸形態(tài)學(xué)參數(shù)突觸數(shù)密度(Nv)、面密度(Sv)和平均面積(S)的體視學(xué)測量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由第一作者完成。數(shù)據(jù)用±s表示,采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間的跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)、超微結(jié)構(gòu)各參數(shù)采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析納入動(dòng)物50只,48只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析,模型組和模型電針組各有1只動(dòng)物因胃飼誤入氣管致死。

2.2跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù))結(jié)果表 1顯示,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙,潛伏期縮短,錯(cuò)誤次數(shù)增加(P＜0.01)。與模型組比較,電針治療能夠改善大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能,延長潛伏期和減少錯(cuò)誤次數(shù)(P＜0.05,P＜0.01)。

表1 各組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù))比較 (±s)

表1 各組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù))比較 (±s)

與空白組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 n 學(xué)習(xí)記憶潛伏期/s 錯(cuò)誤次數(shù)/次 潛伏期/s 錯(cuò)誤次數(shù)/次空白組 10 30.79±4.02 4.12±1.49 234.60±36.52 0.91±0.56空白電針組 10 32.68±5.67 4.44±1.42 226.11±37.74 0.67±0.51模型組 14 25.60±3.131) 6.32±1.411) 159.30±23.421) 2.51±1.081)模型電針組 14 31.10±4.882) 4.22±1.312) 191.24±33.743) 1.45±0.963)

2.3海馬CA1區(qū)突觸電鏡結(jié)果空白組、空白電針組神經(jīng)氈內(nèi)可見大量突觸,突觸前后成分境界清楚,輪廓完整,突觸前終末內(nèi)突觸小泡多,分布密集均勻,多為圓形清亮小泡(圖1A和1B)。模型組神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目減少,突觸前膜不清晰,突觸間隙模糊,前、后膜不明顯,突觸小泡明顯減少甚或消失,突觸前、后膜破壞變薄,典型的突觸結(jié)構(gòu)已不存在(圖1C)。模型電針組神經(jīng)氈內(nèi)可見較多突觸,突觸前終末內(nèi)突觸小泡也較多,可見較多圓形清亮小泡,密集分布,突觸前、后膜較模型組增厚,與空白組接近(圖1D)。表2結(jié)果表明,與空白組比較,模型組大鼠海馬CA1區(qū)突觸面數(shù)密度、面積密度和體積密度勻減小(P＜0.05和P＜0.01);模型電針組大鼠海馬CA1區(qū)突觸面數(shù)密度、面積密度和體積密度勻有所增大(P＜0.05),提示電針能有效抑制突觸減少。

表2 各組大鼠海馬 CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)各參數(shù)比較±s)

表2 各組大鼠海馬 CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)各參數(shù)比較±s)

與空白組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01

電 鏡組別 n 面數(shù)密度(個(gè)/μ m2)面積密度(μ m2/μ m3)體積密度空白組 5 6.89±1.53 0.66±0.15 0.066±0.016空白電針組 5 6.43±1.42 0.68±0.18 0.063±0.017模型組 5 4.54±1.531) 0.46±0.141)0.041±0.0122)模型電針組 5 6.16±1.323) 0.60±0.143) 0.056±0.0153)

圖1 海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)

3 討論

老年癡呆是老年期發(fā)生的以認(rèn)知與智能障礙為主要特點(diǎn)的疾患,中醫(yī)又稱為“老年呆病”,其病位在心、腦。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有“心者,君主之官,神明出焉”、“心者,五臟六腑之大主,精神之所舍也”等觀點(diǎn)。中醫(yī)防治老年性癡呆癥主要是從整體的角度去分析這一病證的內(nèi)在實(shí)質(zhì),針對(duì)某一病證個(gè)體做出客觀的判斷,實(shí)施針對(duì)性很強(qiáng)的防治措施。本研究所選百會(huì)穴為髓海的上輸穴,治療髓海不足健忘、老年性癡呆的要穴;大椎穴是手足六陽經(jīng)的交會(huì)穴,為“諸陽之會(huì)”;百會(huì)穴和大椎穴均為督脈之穴,二穴相配可通調(diào)諸經(jīng),激發(fā)經(jīng)氣,增強(qiáng)各臟腑經(jīng)絡(luò)之功效,使腦髓得氣血榮養(yǎng),促使陰陽平衡。腎俞為膀胱經(jīng)穴位,可益腎填髓充腦,《靈樞·經(jīng)脈》言“膀胱足太陽之脈,起于目內(nèi)眥,上額交巔。其直者,從巔入絡(luò)腦”。足三里為強(qiáng)壯保健的要穴,有延緩衰老的作用。如此配穴體現(xiàn)了配穴原則中的局部與遠(yuǎn)道取穴的結(jié)合運(yùn)用。數(shù)穴合用,臨床上取得較好療效。

有研究表明,D-半乳糖致亞急性衰老模型、慢性鋁中毒和東莨菪堿中毒都能模擬老年癡呆樣改變[2-4],三種因素復(fù)合的模型能更貼近AD復(fù)雜的病因和病理變化過程,在這種模型上研究針刺作用效果所得出的結(jié)論可能更加可靠。從本研究建立的集衰老、鋁中毒與東莨菪堿損害的多因素AD大鼠模型行為學(xué)觀察表明,大鼠跳臺(tái)測試的觸電潛伏期及5 min錯(cuò)誤次數(shù)與對(duì)照組比較均有明顯改變。與空白對(duì)照組比較,模型組潛伏期縮短,錯(cuò)誤次數(shù)增多,說明本研究建立的集衰老、鋁中毒與東莨菪堿損害的多因素的AD大鼠模型是成功的;電針治療后潛伏期延長,錯(cuò)誤次數(shù)減少表明針刺能明顯保護(hù)和改善多因素?fù)p害所造成的大鼠記憶障礙。本研究的結(jié)果提示,針刺可改善AD模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力。

有研究表明,針刺具有拮抗衰老過程中的病理生理變化[5]。電鏡下觀察到電針組海馬區(qū)神經(jīng)氈內(nèi)可見較多突觸,突觸前終末內(nèi)突觸小泡也較多,可見較多圓形清亮小泡密集分布。針刺改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制,可能是針刺刺激增加了大鼠由于造模而損傷壞死的邊緣區(qū)的記憶突觸,即膽堿能突觸,使其密度增加,從而使殘存的神經(jīng)元發(fā)揮更大的作用,使記憶突觸間隙變窄,得以加速突觸間的傳導(dǎo)功能;同時(shí)腦內(nèi)存在一些神經(jīng)傳導(dǎo)的旁路,針刺刺激可引起神經(jīng)沖動(dòng),經(jīng)外周神經(jīng)傳導(dǎo)至中樞神經(jīng)系統(tǒng),經(jīng)平時(shí)少起作用的旁路刺激大腦皮質(zhì),從而引起壞死邊緣區(qū)突觸數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變;突觸后膜致密物質(zhì)厚度增加,可能與某些酶及其底物蛋白的磷酸化過程引起其分子構(gòu)型改變有關(guān),這可能是功能變化的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。針刺作為一種對(duì)機(jī)體無損傷性治療手段,將會(huì)在臨床防治AD和其他衰老疾病方面發(fā)揮重要作用,本研究為臨床進(jìn)一步推廣提供了必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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