土著微生物原位修復石油污染土壤試驗研究

陳立，萬力，張發旺，何澤

1.中國地質大學（北京）水資源與環境學院，北京100083；2.中國地質科學院水文地質環境地質研究所，河北 石家莊 050061

我國西北黃土高原地區由于石油資源的大量開采利用，產生了許多環境問題，尤其是落地原油的污染已影響土壤的質量安全。土壤石油污染的防治研究工作已受到人們的重視，利用微生物修復石油污染土壤技術的開發與研究也受到國內外學者的廣泛關注[1-6]。微生物修復技術主要機理是石油烴直接參與了微生物的生化反應，微生物利用石油烴作為生長所需的碳源和能源，并在酶的催化下將其水解成甘油、脂肪酸，最后降解為 H2O、CO2等代謝產物[7]。Jorgensen[8]的試驗顯示，經生物堆埋，被石油污染的土壤中石油可降低 71%。目前已知能降解石油中各種烴類的微生物共有約100余屬200多種，它們分屬于細菌、放線菌、霉菌、酵母以及藻類[9]。以往的報道多為室內實驗研究，現場原位修復鮮有報道。本文選擇陜北某油井旁污染土壤，利用放大培養的土著微生物菌劑，輔以物理和化學的方法，通過野外原位試驗的方法，開展微生物修復石油污染土壤技術的試驗研究，探索微生物修復技術在黃土區石油污染土壤修復的有效性、科學性、生態性，以期為當地的水土保持和生態環境保護提供技術支撐。

1 試驗材料和方法

1.1 場地背景

場地位于陜西安塞西北約20 km某采油場內，黃土土壤，試驗深度0～15 cm，土中含有少量2～10 mm的小礫石，土壤濕容重為1.821 g·cm-3；自然含水量為 9.18%；pH 為 8.4；NO3-質量分數為 55.3 mg·kg-1；NH4+質量分數為 8.85 mg·kg-1；石油質量分數為 1.3～4.6 mg·kg-1。

1.2 材料

1.2.1 化學試劑 MgSO4·7H2O、NH4NO3、CaCl2、FeCl3、KH2PO4、K2HPO4、KCl、鹽酸、石油醚、三氯甲烷等，均為分析純，主要由北京北化精細化學品公司和天津市四通化工廠生產，生化試劑主要從北京陸橋技術有限責任公司購置。

1.2.2 填加劑 谷糠黍糠、麥麩等

1.2.3 試驗用水 為當地淺層潛水，pH為8.2，可溶性固體總量(TDS)為 420.5 mg·L-1；

1.2.4 試驗所用的石油 為當地原油，油層深度為2400 m。

1.2.5 主要儀器 QZD-1型電磁振蕩器、KQ218超聲波清洗器、生物恒溫箱、高速離心機、高壓蒸汽滅菌器、無菌實驗室、生化培養箱、752N紫外可見光光柵分光光度計、pHB-3型pH計、DDB-303A型電導率儀、電熱干燥箱等。

1.3 方法

1.3.1 測試方法 石油、NO3-采用紫外分光光度法、NH4+采用納氏試劑比色法、pH用pH計測試，TDS用電導率儀測試換算得出。

1.3.2 降解石油微生物細菌培養優選方法 土壤微生物細菌培養用《土壤微生物研究法》[10]和參考文獻[11-13]介紹的方法，細菌初步鑒定用《常見細菌系統鑒定手冊》[14]中的方法。

2 試驗過程

2.1 菌種的分離與優選

用細菌的選擇性培養基和富集培養基，對試驗場石油污染土壤的樣品進行菌種、菌群的培養分離，選擇優化出試驗用降解土壤石油的土著菌種、菌群。選擇優化出的土著細菌經初步鑒定，主要為：假單胞菌屬（Pseudomonas）、微球菌屬（Micrococcus）、放線菌屬（Actinomayces）、真菌類的青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）等菌群。

2.2 試驗小區的設置和步驟

2.2.1 試驗小區設置為 試驗區 1、試驗區 2、對照區、空白區。小區規格為：120 cm×120 cm，各小區相間20 cm，小區由西向東一字排列。

2.2.2 試驗步驟

用當地取得的原油作碳源(污染物)，根據試驗用接種量將選擇優化出的各土著菌種、菌群進行放大培養，配成菌液制劑。將試驗區、對照區和空白區的土壤進行人工反復翻耕，翻耕深度控制在 15 cm左右，其中的土塊盡可能的打碎。在試驗區1、試驗區2和對照區土壤翻耕深度內均勻混入一定量的石油。在試驗區1中按試驗土壤質量的2.5%混入谷糠黍糠，在試驗區2中按試驗土壤質量的2.5%混入麥麩，作為添加劑；將一定量（占試驗土壤質量的 3%）的土著菌液制劑用噴霧器均勻地接入試驗區1和試驗區2的土壤中，根據培養基成分比例加入氮、磷、鈣、鎂、硫、鐵等調控營養元素，用當地地下水調節土壤水分質量分數至20%左右。對照區只加入一定量的石油，未加其它成分，作為自然降解。最后進行反復翻耕以便各種試驗材料混合均勻，在試驗區覆蓋塑料薄膜便于保溫、保濕、防雨。空白區不加任何物質作為監控樣品。每次取樣后，翻耕土壤層使其暴氣充氧并補水，保持土壤水分質量分數在20%左右。

2.3 取樣及測試

按一定時間間隔分別在各個區取樣測試，每個區中以梅花狀取5個不同點的同一深度土樣，然后在盤子里混合均勻用4分法取樣測試。試驗完成后分別對各區試驗層以下一定深度內分層取樣。測試項目包括：石油烴總量、pH、土壤易溶鹽、水分質量分數、NH4+質量分數、NO3-質量分數等，并同時監測地表及試驗土壤溫度。

3 結果與討論

3.1 土壤中石油的去除率

在試驗的0、3、7、11、16、21、26 d和32 d分別在試驗區、對照區和空白區中取樣測試，結果見表1和圖1

從表1、圖1中可見，試驗區和對照區中0～7 d內，石油含量變化均很小，降解率均小于 8%且變化不大，說明試驗區撒入的優勢土著菌劑并沒有發揮作用；同時，該現象也說明土著微生物本身對土壤中的石油污染物具有降解作用；兩個試驗區的降解率比對照區的降解率略高，這是因為試驗區中加入的氮、磷、鈣、鎂、硫、鐵等調控營養元素對土著微生物有激化的作用。

表1 各區土壤中石油質量分數隨時間變化Table 1 Results of oil contents with time in the soil of experimental plots mg·kg-1

圖1 試驗過程中各區土壤中石油累計降解率隨時間變化Fig.1 Cumulative degradation rate of oil with time in experimental plots through experimental process

7天以后兩個試驗區中的石油含量明顯減少，對照區的含量變化不明顯，這是因為試驗區中加入的優勢土著菌劑發揮作用，但該菌劑有延滯期（lag phase）。對比試驗3 d和7 d的數據，可得菌劑的延滯期在3～7 d，然后進入對數期（logarithmic phase）。在試驗的第11 d即對數期后d天，兩個試驗區的累計去除率就達到 69.52%以上，最大累計去除率達88.11%。對比兩個試驗區的數據和曲線趨勢，說明所加入的谷糠黍糠、麥麩兩種添加劑所起作用相差不大。

從對照區的試驗數據看出，土著微生物本身對土壤中的石油污染物具有降解作用，本次試驗累計去除率為20%左右，說明在自然條件下短時間內土壤中石油降解是比較低效且緩慢的。試驗區1的16、21 d測試數據和對照區的16 d測試數據與大趨勢略有差異，這可能是取樣不均所致，也可能是黃土土壤各向異性的性質決定的。

空白區反映了在沒有加任何物質情況下土壤中的石油含量，但在試驗后期因試驗區和對照區與空白區相鄰且加之降雨和人為取樣活動污染了該區，造成含量有所增加。

3.2 試驗過程對下層土壤的影響

試驗完成后，對兩個試驗區、對照區和空白區中不同土壤深度的pH，石油質量分數、水分質量分數、易溶鹽質量分數、NH4+質量分數和NO3-的質量分數進行了測試，結果見表2。從pH、水分質量分數、易溶鹽質量分數、NH4質量分數和NO3-的質量分數來看，可得試驗區有別于對照區和空白區，說明氮、磷等易溶鹽營養物質有一小部分隨水而進入下部土層。從測試結果可見，試驗層以下土壤石油含量增加很少，與對照區和空白區相比只是淺層略高，說明試驗層土壤中石油沒有向下擴散，或少量進入的營養物質激化了下部土層中的微生物降解了下滲的石油。

3.3 修復過程中對影響因素的調控

修復效果關鍵是優化的微生物和微地質環境（土壤環境因子）的相互結合、相互依存、相互作用和調控。調控因素主要有溫度、水、氧氣、營養元素、土壤環境因子的改善等等。試驗過程中對以上因素進行了調控并跟蹤測試，結果見表3、表4、表5。

3.3.1 土壤溫度的調控

溫度是影響微生物生長與存活的重要因素之一，過高或過低的溫度都可抑制微生物生長。適度的溫度可使細菌細胞中的生物化學反應速率加快。試驗區強化的微生物菌群大多為中溫微生物(13～45℃)，25～38 ℃為最適生長溫度。

監測試驗階段地表的最高和最低溫度結果顯示，地表最高溫度在25 ℃以上（在8月下旬至9月上旬），最低溫度在20 ℃，晝夜溫差大。如何調控溫度，是試驗效果好壞的關鍵。在兩個試驗區用塑料薄膜進行保溫，使試驗區土壤溫度保持在25 ℃以上，但進入9月后因氣溫明顯下降夜晚再用草簾覆蓋。從表3可看到試驗區土壤在試驗層15 cm深，溫度明顯增加，比空白區增高5 ℃-8 ℃以上，尤其是在9月上旬以前增溫保溫效果顯著。因此得出在該地區如若利用微生物生態修復技術的最佳時期應在每年的6月下旬至9月上旬，通過調控可使土壤溫度保持在25 ℃以上。

表2 試驗區2、對照區和空白區不同土壤剖面石油、pH、水分、易溶鹽、NH4+、NO3-測試結果Table 2 The test results of oil content, pH, water content, TDS, NH4+ and NO3- with time in the soil of experimental plot 2, control plot and blank plot

表3 9月2日—20日試驗區1與空白區土壤(5～15 cm) 8時與18時的溫度Table 3 Temperature of soil (5～15cm) in experimental plot 1 and blank plot at 8:00 and 18:00 ℃

表4 試驗區1、對照區和空白區土壤pH、水分質量分數隨時間變化測試結果Table 4 The test results of soil pH and water content with time in the soil of experimental plot 1, control plot and blank plot

表5 試驗區2、對照區和空白區土壤易溶鹽、NH+、NO-43質量分數隨時間變化測試結果Table 5 The test results of soil TDS, NH4+ and NO3-with time in the soil of experimental plot 2, control plot and blank plot

3.3.2 土壤pH、濕度分析

每一種微生物的生存都有一定的pH值范圍和最適pH值。大多數細菌的最適pH值為6.5～7.5，放線菌pH值為7.5～8.0，真菌則可以在廣泛的pH范圍內生長發育。由表 4知試驗區 pH值保持在7.6～8.4，這是定期補充一定量的磷酸鹽緩沖劑的結果。表中所示pH多在8左右，這與大部分石油降解菌最適環境為偏堿性的性質相符。而空白區、對照區 pH值在 8.1～8.9比試驗區略高一些。但在此pH值范圍內對此次試驗影響不大，試驗區加入的磷酸鹽主要是為微生物的生長增加營養元素。

水是微生物對石油污染物降解過程中的重要介質和氧的來源。前人研究表明，土壤濕度保持在20%以上對試驗效果有利。因此，每次取樣后在試驗區加入15 L（約占試驗土層的4%）的水。在表4數據顯示試驗層土壤水分質量分數保持穩定，這一含量基本保證了試驗效果。空白區為天然變化的水分質量分數，對照區因取樣后人為的翻耕可起到一定的保水作用，水分質量分數略高于空白區，并沒有對土壤石油降解起到足夠的作用，當然這僅是

3.3.3 易溶鹽、NH4+、NO3-質量分數分析

營養元素可參與微生物細胞組成、構成酶的活性成分和物質運輸系統以及提供生理活動所需能量。在試驗期，微生物必定消耗大量的營養元素。因此，每次取樣后補充一定量的N、P及S、K、Ca、Mg、Fe等微量元素調控營養物質。所加谷糠黍糠、麥麩作為添加劑補充其它生物素和營養鹽。表5為試驗區2、對照區和空白區中易溶鹽、NH4+、NO3-質量分數隨試驗過程的變化，從中可見試驗區于8月21日補充了各種營養元素，反映出隨試驗進程微生物活動將石油和各類元素利用、降解、轉化的過程。表中8月23日至30日土壤含鹽量是增高的，顯示出添加劑的礦化為土壤增加了易溶鹽類元素，該過程驗證了本次試驗添加的營養元素是比較適度。對照區、空白區則反映了自然條件下的變化，降雨使其質量分數降低。

3.3.4 土壤中氧的調控

環境條件的調控包括氧氣的供給，供氧量的多少能影響微生物細胞內許多酶的活性和細胞的呼吸作用，控制著微生物的生長和對有機物的降解能力，影響著微生物對污染石油的降解速度。本試驗主要從四個方面對土壤氧的供給進行了調控，試驗前及每次取樣后均要翻耕試驗層，使其充分與大氣混合；其次是土壤具有一定的水分，水中提供的氧；另外添加劑的投加，它不僅為土壤補充營養，而且增大了土壤的蓬松性和通透性。另外，加入 NO3-不僅增加氮源也增加了氧的來源渠道。原因之一。

4 結論

試驗對陜北某油田的石油污染土壤的樣品進行菌種、菌群分離、選擇，最終確定假單胞菌屬（Pseudomonas）、微球菌屬（Micrococcus）、放線菌屬（Actinomayces）、真菌類的青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）等菌群。對這些菌群進行放大培養，進行油污土壤修復試驗研究。兩個試驗區土壤中人為添加石油質量分數分別為1542、1886 mg·kg-1時，經過11～32 d土著微生物原位修復，土壤中的石油累計降解率可達69.52%～88.11%，而對照區土壤中人為添加的石油含量變化不大，累計去除率在20%左右，說明在自然條件下土壤中石油降解是緩慢的。谷糠黍糠、麥麩兩種添加劑對優化菌液的修復效果的作用基本相同。試驗說明試驗層土壤中石油沒有向下部涂層擴散，或少量進入的營養物質激化了下部土層中的微生物，從而降解了下滲的石油。試驗過程中對土壤溫度、水分、氧和營養物質等影響因素進行了調控，起到了良好的作用。

本試驗驗證了土著微生物原位修復技術在現場修復石油污染土壤的試驗效果是顯著的，方法是可行的。

[1]SANJEE MISHRA, JEEVAN JYOT.In situ bioremediation potential of an oily sludge-degrading bacterial consortium[J].Current Microbiology, 2001, (43): 328-335

[2]JOSEL R G, JORGE L, JUAN F L, et al.Bioremediation of diesel contaminated soil: Evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation[J].Biodegradation, 2001, 12: 325-335.

[3]WIDDL E.The genome sequence of an anaerobic aromatic-degrading denitrifying bacterium strain EbN1[J].Archives of Microbiology, 2005,183: 27-36.

[4]楊雪蓮, 李鳳梅, 劉婉婷, 等.高效石油降解菌的篩選及其降解特性[J].農業環境科學學報, 2008, 27(1): 0230-0233.YANG Xuelian, LI Fengmei, LIU Wanting, et al.Isolation of petroleum-degrading strains and their degrading characteristics[J].Journal of Agro-Environment Science, 2008, 27(1): 0230-0233.

[5]姚治華, 王紅旗, 劉敬奇, 等.石油污染土壤中苯降解菌的篩選及降解特性研究[J].農業環境科學學報, 2006, 25(6): 1498-1503.YAO Zhihua, WANG Hongqi, LIU Jingqi, et al.Screening and characterization of benzene degrading bacterium in oil-contaminated Soil[J].Journal of Agro-Environment Science, 2006, 25(6):1498-1503.

[6]鄭金秀, 彭祺, 張甲耀, 等.優勢降解菌群生物強化修復石油污染土壤[J].農業環境科學學報, 2006, 25(5): 1212-1216.ZHENG Jinxiu, PENG Qi, ZHANG Jiayao, et al.Bioremediation of oil-contaminated soil bioaugmented with consortium bacteria[J].Journal of Agro-Environment Science, 2006, 25(5): 1212-1216.

[7]DEBONTJ A M.Solvent-tolerant bacteria in biocatalysis[J].Trends Biotechnol, 1998, 16: 493-499.

[8]JORGENSEN K S, PUUSTINEN J, SUORTTI A M, et al.Bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminated soil by composting in biopiles[J].Environmental Pollution, 2000, 107(2): 245-254.

[9]沈鐵孟, 黃國強, 李凌, 等.石油污染土壤的原位修復技術.環境科學動態, 2002, (3): 13-15.SHEN Tiemeng, HUANG Guoqiang, LI Ling, et al.In-situ remediation technique for oil-polluted soil[J].Environmental Science Trends,2002, (3): 13-15.

[10]中國科學院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京: 科學出版社, 1985: 51-59.INSTITUTE of SOIL SCIENCE.Chinese academy of sciences.Methods for Studying Soil Microbial[M].Beijing: Science Press, 1985:51-59.

[11]林力, 楊惠芳, 賈省芬.石油污染土壤的生物整治研究.上海環境科學, 2000, (7): 325-329.LIN Li, YANG Huifang, JIA Shengfen.Study on bioremediation of petroleum-polluted soil[J].Shanghai Environmental Sciences, 2000,(7): 325-329.

[12]張海榮, 李培軍, 孫鐵珩, 等.四種石油污染土壤生物修復技術研究.農業環境保護, 2001, 20(2): 78-80.ZHANG Hairong, LI PeiJun, SUN Tieheng, et al.Bioremediation on 4 soils contaminated by petroleum oils using prepared bed processes[J].Journal of Agro-Environment Science, 2001, 20(2): 78-80.

[13]何翊, 吳海, 魏薇.石油污染土壤菌劑修復技術研究[J].土壤,2005, 37(3): 338-340.HE Yi, WU Hai, WEI Wei.Bacteria-based biorremediationI technique for oil-polluted soil[J].Soils, 2005, 37(3): 338-340.

[14]東秀珠, 蔡妙英,..常見細菌系統鑒定手冊.北京: 科學出版社,2001: 97-390.DONG Xiuzhu, CAI Miaoying.Common manual of systemaic bacteriology[M].Beijing: Science Press, 2001: 97-390.