心理應激對實驗性2型糖尿病傾向大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA和CRFmRNA表達的實驗研究*

劉艷民，李 杰，李慶和，李慧吉，韓 娟

010000 內蒙古師范大學（李 杰）

300193 天津中醫藥大學（李慧吉，韓 娟）

近年來，用心理應激源為刺激，以即刻早期基因（IEG）中的c-fosmRNA的表達作為基因細胞代謝活動標志，對心理應激的腦機制開展了大量的研究。心理應激作用與大腦改變腦的內分泌機能，其中最重要的途徑是下丘腦—垂體—腎上腺軸（HPA）被激活，下丘腦室旁核部位的c-fos表達可能作為第三信使調節CRF表達，進而控制ACTH的分泌，啟動HPA軸，影響與應激有關的行為、神經內分泌免疫活動。研究證明應激可通過植物神經系統和中樞神經內分泌系統兩條途徑影響胰島素抵抗和β細胞功能，進而影響2型糖尿病發生。然而中樞神經內分泌系統如何影響糖尿病發生的通路還未完全明了。根據前期實驗中血糖變化，我們推測心理應激引起2型糖尿病病生理改變的機制可能與激活大腦IEG表達相關。本實驗采用原位雜交技術，觀察心理應激對下丘腦室旁核即刻早期基因（cfos）mRNA和CRFmRNA表達的影響，同時觀察了心身5號對其表達的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wister大鼠120只，體質量120～150g。由軍事醫學科學院第四研究所提供。適應性飼養1周。動物室內自然光照。室溫保持24℃,通風良好。飼以全價營養料，自由進食飲水，除實驗應激外無其他不良刺激。

1.2 實驗動物模型及分組

1.2.1 實驗性糖尿病動物模型 120只大鼠隨機分為兩組，一組為40只，另一組為80只。80只大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司產品，溶解在0.1 mol/L檸檬酸緩沖液內，pH為4.0），30 mg/kg,1次/d，連續2 d（參考《現代藥理實驗方法與技術》）。余40只大鼠注射等量檸檬酸緩沖液，1次/d，連續2 d。注射30日后測查大鼠空腹血糖，以9.3 mmol/L為標準（參考《現代藥理實驗方法與技術》），篩除高血糖鼠，再隨機選取45只STZ鼠和20只正常鼠進入應激造模實驗。

1.2.2 動物分組 全部動物共分為5組，其中45只STZ大鼠隨機分為3組，即單純STZ組（無應激）、STZ+應激組、中藥組（STZ＋應激），15只/組。20只正常大鼠分為應激組和正常組，10只/組。

1.2.3 動物模型實驗方法 參照Carter等[1]、姚樹橋等[2]方法，改良后建立本實驗應激方法。

1）限制：將大鼠放入20 cm×5 cm×5 cm塑料筒中，水平置于實驗臺，保證大鼠不受壓。以不能回轉身為度，但其運動受限制，光線晦暗，限制刺激每周隨機擇時進行3次，每次45 min。2）旋轉：利用舊式唱機改裝為旋轉器，轉速為45 r/min，在此轉速下離心力最小，避免離心力過大傷害大鼠。旋轉時將大鼠置于代謝籠中。旋轉刺激每45～150 min內擇時進行1次，每次15～20 min。旋轉刺激隔日進行1次。3）擁擠：標準大鼠飼養籠，按應激組15只/籠，非應激組5只/籠喂養。刺激貫穿于實驗全過程，持續6周。

2 中藥制備和給藥方法

心身5號由旋覆花、代赭石、陳皮、茯苓、半夏、竹茹、丹參、赤芍、降香、烏藥、栝樓、遠志、炙枇杷葉、合歡皮、知母、蒼術、龍齒、黃芩組成，自動煎煮機煎煮，濃縮后置于-20℃冰箱貯藏備用。中藥組大鼠灌胃2 mL/次（其生藥濃度為960g/L），2次/d至實驗結束，余組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，2次/d。

3 實驗指標測定

3.1 下丘腦即刻早期基因c-fosmRNA表達測定 主要試劑：c-fosmRNA原位雜交檢測試劑盒（天津TBD生物技術發展中心提供）。實驗操作步驟：常規脫水，浸蠟，包埋。切片厚度為5 um，置于預先用多聚賴氨酸處理過的載玻片上。石蠟切片經常規脫蠟至水。3%雙氧水（H2O2）室溫處理10 min，滅活內源性過氧化酶。切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的復合消化液（1 mL 3%檸檬酸加入2滴濃縮型復合消化液，混勻），37℃消化5～20 min。暴露目的基因mRNA核酸片段。0.5 mol PBS洗3次×5 min。蒸餾水洗1次。雜交盒中加入5～10 mL蒸餾水。每張切片加20 uL含CRF寡聚核苷酸探針雜交液。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在玻片上。恒溫箱37℃雜交30～120 min。雜交后揭去蓋玻片。30～37℃左右水溫的2×SSC洗滌5min×3次。

每張切片取2 uL雜交探針穩定液A和18 uL雜交探針穩定液B，混勻，加在切片上，濕盒中37～40℃反應20 min。2×SSC洗滌5 min×3次。滴加封閉液，37℃20 min。甩去多余液體，不洗。滴加兔抗地高辛，37℃60 min。0.5 mol PBS洗2 min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG,37℃20 min。0.5 mol PBS洗2 min×3次。滴加 SABC，37℃ 20 min。0.5 mol PBS洗2 min×4次。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加在標本上。顯色20～30 min。蘇木素復染，充分水洗。乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

4 下丘腦促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）mRNA表達測定

主要試劑、實驗試劑配置、實驗步驟同上。

5 統計分析

采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統（由武漢同濟醫科大學千屏影像工程公司提供），對各組動物下丘腦室旁核切片進行定量分析。隨機選取各組下丘腦室旁核6～7視域，于400倍高倍鏡下，以0.2073 um像素點長，在1.219×103um2測量窗下，測取棕色反應物的面數密度、總數目、總面積、平均灰度值，分析下丘腦室旁核內c-fosmRNA和CRFmRNA表達的相對水平。測量數據采用方差分析進行統計。

6 實驗結果

6.1 各組實驗大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達量比較 見表1。

表1 各組大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達比較（±s）

表1 各組大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達比較（±s）

注：與正常組相比 ★★P＜0.01，與應激組相比◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與單純 STZ 組相比 ▲▲P＜0.01，與 STZ+應激組相比☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別正常組應激組單純STZ組STZ+應激組中藥組n 10 10 12 15 14總面積52.17±17.42 281.69±96.89★★219.59±65.02 391.48±71.69▲▲◆303.44±27.72☆總數目1.17±0.408 6.50±1.871★★2.83±0.408 11.83±3.971▲▲◆◆5.50±1.225☆☆面數密度9.57±3.35 47.69±16.13★★23.24±3.37 89.07±32.58▲▲◆45.12±10.05☆☆

6.2 各組實驗大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達量比較 見表2。

表2 各組大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達比較（±s）

表2 各組大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達比較（±s）

注：與正常組相比★★P＜0.01，與單純STZ組相比▲▲P＜0.01；與應激組相比◆P＜0.05，與 STZ+應激組相比☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別正常組應激組單純STZ組STZ+應激組中藥組n 10 10 12 15 14總面積37.84±9.58 219.22±86.58★★138.79±33.72 300.57±176.46▲▲181.99±62.08☆總數目1.33±0.516 5.61±1.966★★2.33±0.516 8.67±2.658▲▲◆3.83±0.753☆☆面數密度9.57±3.35 54.69±16.13★★19.14±4.23 71.07±21.79▲▲◆31.43±6.17☆☆

7 討論

研究證實，應激誘導的c-fos表達多見于室旁核背、腹側富含CRF和ACTH神經元的小細胞區[3]。Imaki等[4]用c-fosmRNA探針研究PVA在束縛應激后c-fosmRNA水平變化的時程關系，c-fosmRNA及CRFmRNA水平變化的時程關系，c-fosmRNA的最高水平在應激開始后120～180 min，且c-fosmRNA和CRFmRNA的表達是同步增加的。根據這些研究資料，有人推測CRFmRNA就是c-fos的下游靶基因[5]，當心理應激發生時，下丘腦首先被激活，在PVN有c-fos和c-jun mRNA轉錄，繼而表達FOS和JUN蛋白，FOS與JUN蛋白形成二聚體，作為第三信使與CRFmRNA啟動子上AP-1位點結合，激活CRFmRNA，使下丘腦PVN小細胞分泌神經元分泌CRF，啟動HPA軸。

本實驗研究中發現，應激刺激可引起正常大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA轉錄活動增強，下丘腦室旁核CRFmRNA表達同步增加，尤其STZ＋應激組大鼠各項指標的含量增加更顯著，推測可能是應激導致下丘腦PVN中c-fosmRNA表達及FOS蛋白合成增多，結果引起其下游靶基因CRFmRNA表達增多，激活HPA軸所致。由于STZ大鼠存在心理和病理雙重應激作用，因而各項指標含量增加更明顯。因此我們認為不良心理應激誘發2型糖尿病大鼠發病可能與應激激活HPA軸中c-fosmRNA和CRFmRNA在細胞分子水平表達過多有關[4-5]。

針對心身疾病共同的病機為氣機失調（主要以氣滯、氣逆為主）及由其所產生的瘀血、寒結、熱結或寒熱互結的基本病理變化，同時結合糖尿病自身的病機特點為陰虛燥熱，課題組提出理氣降逆，散結活血，滋陰清熱為糖尿病的基本治則，并擬定心身5號方藥。實驗結果表明心身5號具有干預心理應激引起HPA通路的激活的作用，間接證實心理應激誘發實驗性2型糖尿病基本病機氣機失調的客觀存在，應激激活HPA軸中c-fosmRNA和CRFm－RNA在細胞分子水平表達過多可能是其客觀實質。本實驗說明心身5號既可整體調整氣機，又對具體疾病有所專攻，是治療心身疾病糖尿病的有效臨床方劑。

[1]Carter W R,Herman J,Stokes K.Promotion of diabetes onset by stress in BB rats[J].Diabetologia,1987,30：674-675.

[2]蔡偉雄，姚樹橋，戴曉陽，等實驗性應激對STZ昆明小鼠血糖水平影響的對照研究[J].中國心理衛生雜志,1999，13（5）：287－289.

[3]Sharp F R,Sagar SM,Hichs K,et al.C-fos mRNA,FOS.and FOS_related antigen induction by hypertonic saline and stress[J].J Neuroscience.1990，21：2321-2331.

[4]Imaki T,Shibasaki T,Wang XQ,et al.Intracerebrovetricular administration of corticotropin-releasing factor antagonist attenuates c-fos mRNA expression in the paravetricular nuleus after stress[J].Neuroendocrind,1995,61：445-452.

[5]Culloan WE.FOS expression in forebrain afferenta to the hypothalamic paravetricular nuleus following swim stress[J].J Comp Neurol.1996,368（1）：88-99.