探索學習對局灶性腦梗死大鼠梗死灶周圍皮質巢蛋白及突觸素表達的影響

槐雅萍,楊永軒,賈子善,郭宗成,賈新鳳

本文要點

1 探索學習大鼠腦梗死灶周圍皮質巢蛋白陽性神經元數在造模后第7、14天明顯多于手術對照組,提示探索學習可能通過增強腦梗死大鼠巢蛋白的表達,來保護神經元免受缺血缺氧損傷,促進腦功能的重組。

2 除大腦室管膜下區、海馬齒狀回外,海馬 CA1～4區、缺血灶周圍皮質也可見巢蛋白的表達。推測腦缺血損傷可能刺激腦內成熟的間質細胞或星形膠質細胞返回到神經干細胞狀態,重新分化成神經元。

3 探索學習與突出素的表達呈正相關;大鼠經過探索學習訓練,隨著時間的延長,突出素的反應產物明顯增多。

中樞神經系統可塑性變化是康復治療的機制之一。半個世紀前,就有學者提出神經皮質的連接可因個體的經歷 (如學習、感覺刺激、物理刺激等)而發生改變,腦功能代表區的改變也是如此。探索學習是指動物主動去接受新的信息而改變自身行為、適應新環境的過程,是不斷用新記憶取代舊記憶的過程[1],主要用來訓練動物的學習、記憶、空間辨別、覓食等本能性行為能力,促進受損的行為學功能的恢復。有研究表明探索學習能明顯促進腦梗死大鼠的行為學恢復[2],但對腦卒中后行為學能力恢復的分子作用機制尚不清楚。本研究擬觀察探索學習對局灶性腦梗死大鼠梗死灶周圍皮質巢蛋白 (nestin)及突觸素 (synaptophysin,SYP)表達的影響,探討探索學習對腦梗死后功能恢復影響的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性 SD大鼠 70只,3～4月齡,體質量 230～260 g,購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部。合格證號 SCXK(鄂)2004—0007。將動物隨機分為大腦中動脈栓塞 (MCAO)模型組60只,假手術組 10只。

1.2 試劑與儀器 戊巴比妥鈉購自上海生工公司;多聚甲醛(分析純)購自天津市化學試劑研究所;兔抗大鼠巢蛋白多克隆抗體購自北京中杉金橋;小鼠抗大鼠突觸素多克隆抗體購自武漢博士德;筆式高溫電灼器 (北京貝林電子有限公司);手術顯微鏡 (德國 Leica公司);光學顯微鏡 (日本 OLYMPUS公司);圖像分析管理系統 (美國 Media Cybernetics公司)。

1.3 方法

1.3.1 制備 MCAO模型及分組 參照 Bederson等[3]的方法制備 MCAO模型。術后 24 h將大鼠隨機分為探索學習組 30只,手術對照組 30只。假手術組 10只,不電凝大腦中動脈,其余步驟與手術組相同。

1.3.2 造模后飼養環境 (1)假手術組:飼養于標準籠,每籠 5只。(2)手術對照組:飼養于標準籠,每籠 5只。(3)探索學習組:15只一組,飼養于由一個圓籠和一個方籠組成的迷宮籠[2]。直徑 500 mm的圓籠與 640 mm×480 mm×120 mm的方籠中間通過兩通道相連 (圓籠:中間由絲網分隔,一側為進食區,一側為飲水區;方籠:由絲網分隔形成通道寬80 mm×80 mm的迷宮,迷宮由易到難,每周變換 1次)。

1.3.3 標本的制備 分別于術后第 1、7、14、28天從手術對照組和探索學習組隨機取5只大鼠;假手術組于術后第7天隨機取 5只大鼠,第 28天隨機取 5只大鼠。用 10%水合氯醛腹腔內注射麻醉后固定于手術臺,剪開胸腔,暴露心臟,用 9號針頭插入左心室,灌注 0.9%氯化鈉溶液,待右心耳膨起,剪開右心耳讓血液流出,至右心耳流出液為無色透明時開始用4%多聚甲醛灌注固定,先快后慢,每只大鼠約灌注 300 ml,總量在 20～30 min內灌完。固定后立即剖顱取腦,在視交叉處切開,冠狀切取 2 mm厚包含梗死灶區域及左右半球的組織塊浸于 4%多聚甲醛中再固定 4 h。經常規梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。連續冠狀切片,切片厚 5μm。

1.3.4 SP法檢測巢蛋白和突觸素的表達 組織切片常規脫蠟,水化。PBS沖洗 3次,每次 3 min(3×3 min,下同);0.3%過氧化氫室溫孵育 10 min,消除內源性過氧化物酶;PBS沖洗 2×3 min;熱修復 30 min;PBS沖洗 3×3 min;滴加溶液 A(蛋白阻斷液),室溫孵育 10 min,減少非特異性背景染色;PBS沖洗 3×3 min;滴加一抗 (巢蛋白稀釋比例為1∶400;突觸素稀釋比例為 1∶500),置 20%甘油濕盒 4℃恒溫過夜;PBS沖洗 3×3 min;滴加溶液 B(生物素標記的二抗),室溫孵育 10 min;PBS沖洗 3×3 min;滴加溶液 C(過氧化物酶標記的鏈霉菌抗生素蛋白),室溫孵育 10 min;PBS沖洗 3×3 min;DAB顯色;自來水充分沖洗;蘇木素復染;梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.5 染色結果判定 (1)巢蛋白染色結果判定:每只大鼠選取 3張切片,每張切片選取 3個 10×40倍視野,用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統計數陽性細胞數目。(2)突觸素染色結果判定:每張切片在梗死灶周圍皮質隨機選取 3個10×40倍視野,用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統在同一光強度下測量其突觸素吸光度 (optical density,OD)值,同時測量同一張切片胼胝體的 OD值作為背景 OD值,用矯正吸光度 (COD,COD=實測值 -背景值)值進行比較和分析,以避免染色過程中非特異性染色所造成的誤差。

1.4 統計學方法 各組數據以 (x±s)表示,數據處理采用SPSS12.0統計分析軟件,所有數據進行正態性及方差齊性檢驗后,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 梗死灶周圍皮質巢蛋白表達的時程變化 光學顯微鏡觀察發現:梗死灶周圍皮質巢蛋白陽性細胞密集。部分巢蛋白陽性細胞胞體較大呈橢圓形或紡錘形,胞質呈棕褐色,有少量突起,細胞核較大。假手術組皮質神經元胞質未見巢蛋白陽性表達。探索學習組與手術對照組梗死灶周圍皮質巢蛋白陽性細胞數在腦梗死后第 1天即有增加,第 7天達到高峰,染色最深,第 14天和第 28天陽性細胞逐漸減少,染色變淡。腦梗死后第7天和第 14天,探索學習組大鼠梗死灶周圍皮質巢蛋白陽性細胞較手術對照組明顯增多,差異有統計學意義 (P＜0.01),而第 28天時兩組比較差異無統計學意義 (P＞0.05,見表 1、圖 1～3)。

表 1 各組大鼠梗死灶周圍皮質巢蛋白陽性神經元數比較 (x±s,×400)Table 1 Expression of nestin in rats among three groups

2.2 梗死灶周圍皮質突觸素表達的時程變化 突觸素免疫反應產物為棕黃色的點狀或細顆粒狀物,分布密集,部分呈板層樣分布。有些顆粒圍繞在細胞周圍,襯托出細胞輪廓。假手術組皮質可見突觸素呈點狀或顆粒樣。探索學習組與手術對照組梗死灶周圍皮質突觸素表達在造模后第 1天無明顯變化,兩組與假手術組比較差異均無統計學意義 (P＞0.05),兩組之間比較差異亦無統計學意義 (P＞0.05)。第 7天時突觸素表達增多,探索學習組與手術對照組比較差異無統計學意義 (P＞0.05),而兩組與假手術組比較差異均有統計學意義 (P＜0.01)。第 14天時突觸素表達明顯增強,第 28天時最強,且顆粒較粗大,并出現深染的顆粒性產物,密集的小顆粒呈帶狀。探索學習組突觸素表達在第 14、28天較手術對照組增強,差異有統計學意義 (P＜0.01,見表 2、圖 4～6)。

表 2 各組大鼠梗死灶周圍皮質突觸素光密度值比較 (x±s, ×400)Table 2 Expression of synaptophysin in rats among three groups

圖 1 假手術組大鼠皮質巢蛋白的表達Figur e 1 Expression of nestin in cortex in sham group(IHC 400×)

圖 2 手術對照組大鼠在術后第 7天時皮質巢蛋白陽性表達情況Figur e 2 Expression of positive nestin neuron in peri-ischemic cortex in control group at 7 day after MCAO(IHC 400×)

圖 3 探索學習組大鼠在術后第 7天時皮質巢蛋白陽性表達情況Figur e 3 Expression of positive nestin neuron in peri-ischemic cortex in learning group at 7 day after MCAO(IHC 400×)

圖 4 假手術組大鼠皮質突觸素表達情況Figur e 4 Expression of SYN in cortex in sham group(IHC 400×)

圖 5 手術對照組大鼠在術后第 28天時皮質突觸素表達情況Figur e 5 Expression of SYN in peri-ischemic cortex in control group at 28 day after MCAO(IHC 400×)

圖 6 探索學習組大鼠在術后第 28天時皮質突觸素表達情況Figur e 6 Expression of SYN in peri-ischemic cortex in learning group at 28 day after MCAO(IHC 400×)

3 討論

3.1 探索學習環境對梗死灶周圍皮質巢蛋白表達的影響 近十幾年來,人們發現在成年腦組織內存在具有多種分化潛能的神經干細胞 (NSC),正常情況下這些細胞處于靜息狀態,當其所處的微環境發生改變或在外來信號的刺激下,能自我更新,并在一定條件下分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞,參與神經系統的修復,這表明了中樞神經系統 (CNS)具有一定的修復潛能。巢蛋白被認為是 NSC的標志,已廣泛用于 NSC的鑒定。巢蛋白是一種新近發現的第六類中間絲蛋白,這種蛋白在哺乳動物胚胎期 CNS的神經前體細胞內大量表達,動物出生后其表達很快降低并消失[4]。但在少數仍保持神經發生功能的部位 (如大腦室管膜下區、嗅球、海馬齒狀回)仍有表達。這些巢蛋白陽性細胞具有分化和增殖的能力,提示巢蛋白可能參與調節這些細胞的分化與增殖。

隨著 Reynolds等[5-6]在成體腦內發現了 NSC,人們愈來愈認識到,NSC在腦損傷修復中起到了非常重要的作用。大量研究表明,NSC在神經營養因子和內環境的調控下可對因缺血損傷而造成的神經功能喪失產生代償和修復作用[7-8]。在腦缺血的早期即可誘導巢蛋白的表達,從而在腦損傷的修復中發揮主要作用[9]。在損傷最重區域,巢蛋白陽性細胞數目最顯著,故巢蛋白可作為 CNS損傷時最早、快速應答的敏感標志物;另一方面,巢蛋白是 NSC的特異性標記蛋白,NSC具有多分化潛能,可以分化成神經元和膠質細胞,并能自我更新。巢蛋白的高表達可能預示了 NSC的激活,從而在腦損傷的修復中發揮重要作用。本實驗結果顯示,探索學習組大鼠梗死灶周圍皮質巢蛋白陽性細胞的數量在造模后第 7、14天明顯多于手術對照組,提示探索學習可能通過增強腦梗死大鼠巢蛋白的表達,保護神經元免受缺血缺氧損傷,促進腦功能的重組,從而有利于行為學的恢復。

腦缺血不僅可激活 NSC,使 NSC增殖分化,而且也可使缺血灶周圍的某些成熟神經元逆轉為 NSC。Li等[10]的實驗表明,局灶腦缺血后 6～12 h,缺血灶中心區的星形細胞開始表達,隨著時間的推移,缺血灶及周邊區小膠質細胞、單核細胞也表達巢蛋白。更為有趣的是,缺血灶附近的一些神經元也呈現巢蛋白陽性。顯然這些巢蛋白陽性 NSC并非來源于室管膜下層和齒狀回等區,因為他們具有成熟神經元和膠質細胞的特征,提示這種逆向轉化的存在。本實驗發現,除大腦室管膜下區、海馬齒狀回外,海馬 CA1～4區、缺血灶周圍皮質也可見巢蛋白的表達。推測為腦缺血損傷可能刺激腦內成熟的間質細胞或星形膠質細胞返回到 NSC狀態,重新分化成受損最嚴重的細胞類型 (主要是神經元),并遷移至損傷的腦區,從而發揮修復和重排神經元網絡的作用[11]。

腦損傷后,巢蛋白的重新表達與神經營養因子的釋放有關,而不同環境刺激后,各種神經營養因子的表達水平也不同。因此,探索學習誘導局灶性腦梗死大鼠海馬巢蛋白表達,可能是探索學習促進腦梗死后功能恢復的機制之一。

3.2 探索學習環境對梗死灶周圍皮質突觸素表達的影響 突觸素是突觸囊泡膜上的一種與突觸結構和功能密切相關的鈣結合蛋白[12],是突觸發生和突觸可塑性的重要標志,其參與Ca2+依賴性的神經遞質釋放,還參與神經元間信息的傳遞[13]。幾乎所有中樞和周圍神經系統的突觸前終末內均有突觸素,它的表達可以反映突觸的發生和密度,并且它通過與 Ca2+的結合引起神經遞質的釋放,還可影響神經信息的傳遞和加工。它可作為突觸前終末的特異性標記物,用來檢測突觸的密度和分布,是神經元功能狀態的標記物之一。突觸素膜含量的高低可反映突觸神經功能的高低、突觸的信息傳遞、遞質釋放等神經生物功能正常與否。因其與神經生長、修復、再生和突觸重塑密切相關,成為近年來醫學研究的熱點。

腦功能重組是神經康復的重要理論基礎。CNS具有結構和功能重新組織的能力,特別是在損傷后 CNS具有高度的可塑性。軸突出芽、突觸形成、突觸結構和功能的改變是腦功能重組重要的物質基礎。腦缺血損傷可致神經元功能發生不同程度的缺損,隨著缺血時間的延長,機體可通過促進突觸素的合成作用,引起突觸結構和功能兩方面的重建。新突觸形成的方式有兩種:(1)未受損神經元通過軸突繞道投射,樹突不尋常分叉等方式進行突觸重建;(2)海馬齒狀回 NSC增殖、遷移和分化,大量新生神經元到達受損區域,與周圍神經元形成新的突觸連接,以達到代償目的[14-15],突觸前膜功能在缺血后代償性增加也可使突觸素表達升高。本實驗結果顯示,突觸素的免疫活性在第 1天時已有所表達,第 7天時免疫活性增強,可能與未受損神經元的突觸重建有關;第 14天免疫活性明顯增強,第 28天時最強,可能與 NSC的增殖、遷移、分化有關。

許多研究亦表明學習是影響腦可塑性的主要因素之一,學習會增加突觸的數量,改變突觸的結構[16]。當大鼠經水迷宮訓練獲得了空間辨別性學習記憶功能后,在海馬內會引起突觸數量增多、突觸活性區膜面積增加、突觸小泡數量和體積增加等一系列形態學變化,這些變化可以認為是空間辨別性學習記憶在大鼠海馬結構內引起了突觸形態學的可塑性變化[17],而樹突棘可能是長期突觸可塑性的關鍵,直接關系到記憶在大腦的存儲[18]。探索學習能夠向中樞神經提供大量沖動,有利于突觸聯系的建立,激活神經通路,實現神經功能的重組,從而恢復正常的功能。隨著探索學習模型的建立,探索學習的信息不斷傳入腦內,引起腦內突觸的形成或改建。本實驗結果表明,探索學習組大鼠梗死灶周圍皮質的突觸素光密度值在第14、28天較手術對照組為高,有明顯差別,說明探索學習與突觸素的表達呈正相關性。同時本研究也發現,大鼠經探索學習訓練,隨著時間的延長,突觸素的反應產物明顯增多。探索學習引起海馬突觸素表達增加,這可能是探索學習促進腦梗死后神經損傷恢復和功能重組的機制之一。

1 高俊淑,李闊,李娜,等.探索學習對局灶性腦梗死大鼠梗死灶周圍皮質BDNF表達的影響 [J].中國康復醫學雜志,2007,22(7):584-585.

2 賈子善,李闊,槐雅萍,等 .不同環境干預對局灶性腦梗死大鼠行為學恢復的影響 [J].中國康復醫學雜志,2007,22(7):578-580.

3 Bederson JB,Pitis LH,Tsun M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

4 Zhigang Jin,Li Liu,Wei Bian,et al.Different transcription factors regulate nestin gene expression during P19 cell neural differentiation and central nervous system development[J].J Biol Chem,2009,20(3):8160-8173.

5 Reynolds BA,Tetzlaff W,Weiss S.A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes[J].JNeurosc,1992,12:4565-4574.

6 Reynolds BA,Seiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J].Science,1992,255(5052):1707-1710.

7 Larsson E,Mandel RJ,Klein RL,et al.Suppression of insult-induced neurogenesis in adultrat brain by brain-derived neurotrophic factor[J].Exp Neurol,2002,177(1):1-8.

8 Teramoto T,Qiu J,Plumier JC,et al.EGF amplifies the replacement of parvalbumin-expressing striatal interneurons after ischemia[J].Clin Invest,2003,111(8):1125-1132.

9 Liu J,Solway K,Messing RO,et al.Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils[J].Neurosci,1998,18(19):7768-7778.

10 Li Y,Chopp M.Temporal profile of nestin expression after focal cerebral ischemia in adult rat[J].Brain Res,1999,838(1/2):1-10.

11 Abe K.Therapeutic potential of neurotrophic factors and neural stem cells against ischemic brain injury[J].Cereb Blood Flow Metab,2000,20(10):1393-1408.

12 Martinez G,Di Giacomo C,Camazza ML,et al.MAP-2,synaptophysin immunostaining in rat brain and behavioral modifications after cerebral postischemic reperfusion[J].Dev Neurosci,1997,19:457-464.

13 Thiel G.SynapsinⅠ ,SynapsinⅡ and Synaptophysin:marker proteins of synaptic vesicles[J].Brain Pathol,1993,3(1):871.

14 Faverjon S,Silveira DC,Fu DD,et al.Beneficial effects of enriched environment following status epilepticus in immature rats[J].Neurology,2002,59(9):1356-1364.

15 Auvergne R,Lere C,El-bahh B,et al.Delayed kindling epileptogenesis and increased neurogenesis in adult rats housed in an riched environment[J].Brain Res,2002,954(2):277-285.

16 Klintsova AY,Greenough WT.Synaptic plasticity in cortical systems[J].Current Opinion in Neurobiology,1999,9:203-208.

17 宿寶貴,許鹿希 .大鼠海馬結構在空間辨別性學習記憶時的突觸形態可塑性的定量研究 [J].解剖學研究,2000,22(1):40-42.

18 Leggio MG,Mandolesi L,Federico F,et al.Environmental enrichment promotes improved spatial abilities and enhanced dendritic growth in the rat[J].Behav Brain Res,2005,163(1):78-90.