康腦液 1號(hào)對(duì)大鼠腦缺血再灌注半暗帶細(xì)胞凋亡及Bcl-2/Bax比值的影響

薛 茜,鄒玉安,趙寶民,楊向方

腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷,主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等有關(guān)?？的X液 1號(hào)為臨床治療缺血性腦血管病的經(jīng)驗(yàn)組方,臨床療效良好。藥理研究證實(shí)康腦液 1號(hào)組方中單藥如黃芪、三七、葛根等具有擴(kuò)張血管、改善腦血流及微循環(huán)、降低血液黏度及血脂、抑制炎性反應(yīng)等作用[1-4]。神經(jīng)元凋亡是一種受基因調(diào)控的自主性、程序性細(xì)胞死亡過(guò)程,是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。Bcl-2/Bax比值與細(xì)胞凋亡調(diào)控有關(guān)。本研究通過(guò)觀察康腦液 1號(hào)對(duì)局灶性腦缺血再灌注后缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡和 Bcl-2/Bax比值的影響,探討其可能的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠180只,體質(zhì)量 (270±20)g,SPF/UAF級(jí),購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,許可證號(hào):SCXK(京)2006-0008。稱重后隨機(jī)將大鼠分成 5組,每組 36只。 (1)假手術(shù)組;(2)模型組 (缺血再灌注組);(3)鹽酸法舒地爾注射液組;(4)康腦液 1號(hào) A組;(5)康腦液 1號(hào) B組。

1.2 藥物與試劑 康腦液 1號(hào),由黃芪、三七等 8味中藥組成,由河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房煎制。常規(guī)煎煮并濃縮至 4 g/ml。鹽酸法舒地爾注射液 (川威):天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn) (國(guó)藥準(zhǔn)字 H20040356;產(chǎn)品批號(hào):060608;規(guī)格 2 ml:30 mg)。栓線購(gòu)自北京沙東生物技術(shù)有限公司〔產(chǎn)品編號(hào)2432-100,線長(zhǎng)40 mm,線身直徑 0.24 mm,頭端直徑 (0.32±0.02)mm〕。凋亡試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 (產(chǎn)品批號(hào):10090522)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備 康腦液 1號(hào)采用灌胃法,鹽酸法舒地爾注射液采用腹腔注射,均連續(xù)給藥 7 d,每天早晨給藥 1次,最后 1次給藥 1 h后實(shí)施腦缺血再灌注手術(shù),術(shù)后繼續(xù)給藥至再灌注各時(shí)間點(diǎn) (12、24、72 h);給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算,康腦液 1號(hào) A組劑量為 1.5 g·100 g-1·d-1,B組劑量為 3.0 g·100 g-1·d-1。假手術(shù)組和模型組大鼠自手術(shù)日前 7天開始給予等量去離子水灌胃。采用改良 Longa法[5]復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型 (MCAO),大鼠用 7%水合氯醛 (350 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定于大鼠解剖板上;剪去頸右前部手術(shù)區(qū)的毛,碘酒消毒,鋪洞巾,于頸部行 15 mm旁正中縱行切口,并鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈;用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端后,頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎,靠近頸內(nèi)、外分叉處約 5 mm剪一小切口,迅速將栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈直至有輕微阻力感為止,模型組、鹽酸法舒地爾組及康腦液1號(hào) A、B組栓線插入深度為 (20.0±0.5)mm;假手術(shù)組麻醉同上,頸部切口暴露頸外動(dòng)脈,不插線。實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞而致腦缺血;固定栓線去除動(dòng)脈夾,栓線外留約 5 mm,逐層縫合;2 h后提拉栓線頭端退回至頸外動(dòng)脈內(nèi),實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注,造模完成。動(dòng)物清醒后觀察各組的活動(dòng)度并采用 Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分 (0分:無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);1分:對(duì)側(cè)前爪不能充分伸展;2分:行走時(shí)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜;4分:不能行走,意識(shí)喪失),1～3分者納入實(shí)驗(yàn),不符合模型判斷標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物剔除。假手術(shù)組未腦缺血,評(píng)分均為 0分;模型組、鹽酸法舒地爾組及康腦液 1號(hào) A、B組手術(shù)均成功,均符合模型判斷標(biāo)準(zhǔn),納入評(píng)分。

1.3.2 TTC染色及腦梗死體積測(cè)定 缺血 2 h再灌注24 h后,每組隨機(jī)抽取 6只大鼠,快速斷頭取出鼠腦,置冰箱(-20℃)內(nèi) 10 min后,切除嗅腦,取冠狀面從前向后均勻切成 2 mm厚腦片 5～6片,將切片迅速置于 2%TTC溶液 (37℃水浴)中避光條件下染色 30 min。正常腦組織染成紅色,缺血區(qū)呈灰白色,界線清晰。4%多聚甲醛固定 24 h。數(shù)碼相機(jī)攝片,計(jì)算機(jī)圖像分析,求得 TTC染色兩側(cè)正常區(qū)與梗死灶的面積。以缺血對(duì)側(cè)腦片的面積減去缺血側(cè) TTC染色正常區(qū)的面積求得腦梗死面積。

1.3.3 HE染色觀察病理形態(tài) 將實(shí)驗(yàn)大鼠缺血 2 h,至再灌注所需時(shí)間點(diǎn)時(shí),用 7%水合氯醛腹腔注射麻醉,常規(guī)灌注4%多聚甲醛 200 ml固定30 min?？焖贁囝^取腦,從前向后將腦組織分為 A、B、C、D、E 5等分,切成 2～3 mm厚的腦片,選取 C腦片,入 4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定 24 h。常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚度 5μm,4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 腦神經(jīng)元凋亡檢測(cè) 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Td T)介導(dǎo)的地高辛 d UTP缺口末端標(biāo)記法 (TUNEL)來(lái)識(shí)別凋亡細(xì)胞。

1.3.5 Bcl-2/Bax比值測(cè)定 采用 SP法進(jìn)行檢測(cè),陰性對(duì)照用 0.01 mol/L PBS(p H 7.4)代替一抗。嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作,DAB顯色,常規(guī)脫水、透明、封片?？贵w及試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 (PV-6001,批號(hào):K92708D)?？贵w稀釋液:ZL1-9029,批號(hào):546892A。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以 (x±s)表示,采用 SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。多組間均值的比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦梗死體積 大鼠 MCAO術(shù)后多于1.5 h內(nèi)清醒。假手術(shù)組大鼠活動(dòng)度大。模型組大鼠術(shù)后精神較差,反應(yīng)遲鈍,蜷縮扎堆,24 h后仍然有蜷縮扎堆現(xiàn)象?？的X液 1號(hào)組和鹽酸法舒地爾組的大鼠狀態(tài)有一定好轉(zhuǎn),活動(dòng)度較大,無(wú)蜷縮扎堆現(xiàn)象。術(shù)后 24 h康腦液 1號(hào)組和鹽酸法舒地爾組 Longa評(píng)分低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01,見表1)。缺血再灌注6 h即可看到明顯梗死灶,累及右側(cè)大腦半球基底核區(qū)、額頂葉皮質(zhì)及海馬區(qū),隨再灌流時(shí)間的延長(zhǎng)梗死面積逐漸增大,至缺血再灌注 24 h時(shí),模型組梗死面積為 (43.00±0.68)%,康腦液 1號(hào) A、B組分別為(35.20±0.55)%、(35.00±0.37)%?？的X液 1號(hào) A、B組與模型組相比梗死面積明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表 1 各組大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分比較 (x±s,分)Table 1 Comparison of the neuralogical function score

2.2 組織病理學(xué)改變 高倍光鏡下觀察。(1)假手術(shù)組:大腦組織結(jié)構(gòu)完整,無(wú)梗死灶及水腫。神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞未見異常。細(xì)胞膜、核膜清晰,核仁明顯。 (2)模型組:缺血第 1天,缺血對(duì)側(cè),細(xì)胞形態(tài)正常,核仁清楚。缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,排列紊亂,組織間隙水腫嚴(yán)重。缺血半暗帶明顯,神經(jīng)元稍小,形態(tài)基本正常;缺血灶中心區(qū)神經(jīng)元體積明顯縮小,部分細(xì)胞呈三角形,膠質(zhì)細(xì)胞固縮。缺血第 7～14天神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管、小血管與周圍腦間質(zhì)的間隙顯著增大,間質(zhì)疏松。病灶中心區(qū)隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)大量液化性壞死灶及囊性變,后期呈網(wǎng)狀改變,殘存細(xì)胞很少。(3)康腦液 1號(hào) A組和 B組及鹽酸法舒地爾組:在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與模型組相比,神經(jīng)元形態(tài)改變較輕,細(xì)胞體完整,突起較清楚,基本保持完整。可見尚存的大腦皮質(zhì)的正常神經(jīng)元排列結(jié)構(gòu),且組織間隙水腫較模型組明顯減輕,神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管大量變性壞死等缺血性改變和炎性反應(yīng)明顯輕于模型組。

2.3 康腦液 1號(hào)對(duì)大鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡及 Bax/Bcl-2比值的影響 光鏡下 (×400)細(xì)胞核內(nèi)存在棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。在梗死周邊區(qū)隨機(jī)選取 10個(gè)互不重疊視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。各時(shí)間點(diǎn)模型組細(xì)胞凋亡數(shù)及 Bcl-2/Bax比值明顯高于假手術(shù)組 (P＜0.05);與模型組比較,康腦液 1號(hào) A組和 B組、鹽酸法舒地爾組細(xì)胞凋亡數(shù)目減少 (P＜0.05),而 Bcl-2/Bax比值升高 (P＜0.05,見表 2、3)。

表 2 各組大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡數(shù)目比較 (x±s)Table 2 Comparison of the numbers of the neuronal apoptosis cells around the necrotic area in rats

表 3 康腦液 1號(hào)對(duì)缺血再灌注大鼠缺血半暗帶 Bcl-2/Bax比值的影響(x±s)Table 3 The effectsof kangnao ye 1 on the Bcl-2/Bax ratio after the focal cerebral ischemia-reperfusion around the necrotic area in rats

3 討論

近年來(lái),關(guān)于中藥復(fù)方治療腦卒中的研究進(jìn)展迅速。康腦液 1號(hào)中黃芪為君藥,三七、葛根、天麻、川芎共為臣藥,佐以鉤藤、地龍,同時(shí)川芎、地龍又具引藥之性,二藥輕清引上,直達(dá)病所。黃芪益氣升陽(yáng),三七活血止血[6],鉤藤熄風(fēng)鎮(zhèn)驚,地龍清熱利濕,天麻、川芎定風(fēng)[7]。對(duì)腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能為多水平、多通道、多靶點(diǎn)的綜合效應(yīng)。

研究表明,缺血半暗帶的細(xì)胞凋亡與疾病轉(zhuǎn)歸相關(guān)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為維持其內(nèi)穩(wěn)態(tài)的自主程序性死亡 (programmed cell death,PCD)。抑制缺血后神經(jīng)元凋亡對(duì)保護(hù)神經(jīng)元具有重要意義。細(xì)胞凋亡的機(jī)制與凋亡基因表達(dá)有關(guān),即促凋亡基因和抗凋亡基因。Bcl-2、Bax基因是目前研究較明確的一對(duì)在功能上相互對(duì)立的凋亡調(diào)控基因。

Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白,主要分布于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核的外膜[8]。Bcl-2蛋白家族根據(jù)其作用分為 2類:一類為抗凋亡蛋白,如 Bcl-2蛋白;另一類為促凋亡蛋白,如 Bax蛋白?？沟蛲龅鞍缀痛俚蛲龅鞍字g相互拮抗。Bcl-2蛋白能夠抑制 Bax蛋白啟動(dòng)凋亡機(jī)制。而 Bax蛋白作為 Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員,可以不依賴于激活或抑制其他相關(guān)基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序決定于 Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的相對(duì)值,Bcl-2/Bax的比值改變與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[9]。

以往研究顯示腦缺血后促凋亡蛋白 Bax表達(dá)明顯增加,且Bax陽(yáng)性反應(yīng)位于 TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi),其時(shí)程與空間的分布與 TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元一致[10]。Bcl-2/Bax比值的改變可能調(diào)控了神經(jīng)元的凋亡。研究表明,細(xì)胞受刺激后 Bcl-2/Bax比值越高,細(xì)胞存活率越高,細(xì)胞凋亡率越低。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)目、Bcl-2/bax比值均明顯高于假手術(shù)組;Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾注射液對(duì)腦缺血再灌注具有很好的改善作用[11-12],可降低凋亡率,升高 Bcl-2/Bax比值。本研究顯示,康腦液 1號(hào)A組和 B組可上調(diào)腦缺血再灌注誘導(dǎo)的 Bcl-2蛋白表達(dá),同時(shí)下調(diào) Bax蛋白表達(dá),使 Bcl-2/Bax比值升高,可能促使 Bax-Bcl-2異源二聚體形成,抑制細(xì)胞凋亡。康腦液 1號(hào) A組和 B組不同劑量給藥對(duì)大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)目、Bcl-2/bax比值的影響無(wú)顯著性差異,符合臨床中醫(yī)中藥辨證論治理論。中藥組方中各單味中藥之間的比例是關(guān)鍵,而中藥組方的總劑量對(duì)治療無(wú)決定性作用。經(jīng)康腦液 1號(hào)治療后,梗死灶明顯減小,腦神經(jīng)元凋亡減少,Bcl-2/Bax比值明顯高于缺血再灌注組,說(shuō)明康腦液 1號(hào)可能通過(guò)抑制腦神經(jīng)元凋亡,達(dá)到保護(hù)缺血半暗帶目的,從而起到保護(hù)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的作用。

綜上所述,康腦液 1號(hào)可明顯減少 MCAO大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡,其機(jī)制可能與提高 Bcl-2/Bax比值有關(guān),這可能是其促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)及重塑的機(jī)制之一。為臨床應(yīng)用康腦液 1號(hào)治療缺血性腦血管疾病提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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