人類表皮生長因子受體 2的 B細胞表位初步預測分析

周珠哈,王 安,吳 樂,朱珊麗,朱冠保,張麗芳

人類表皮生長因子受體2(HER2/neu)是一種原癌基因,定位于染色體 17q21,編碼一個 185 kDa的跨膜受體酪氨酸激酶,也稱為 p185[1],是表皮生長因子受體 (EGFR)家族的第二成員,HER2/neu自身可形成同源二聚體或與 EGFR其他成員形成異源二聚體,繼而發生磷酸化,激活其胞內酪氨酸激酶,將細胞生長信號和其他相關信號持續地傳導給細胞,最終導致細胞的增殖、癌變、對化療藥物耐受等一系列生物學性狀的改變[2]。HER2/neu基因的擴增或過度表達見于許多上皮源性腫瘤中,如原發性浸潤性乳腺癌 (25% ～30%)、胃癌(10%～20%),其表達程度與腫瘤的臨床分期及預后密切相關[3-4],是不良預后的獨立預測因子[5-6]。曲佐單抗 (herceptin)是人源化的 HER2/neu靶向單克隆抗體,在 HER2/neu過表達的乳腺癌及胃癌患者的臨床治療中取得了顯著療效[7-8]。使 HER2/neu成為理想的抗腫瘤免疫治療的靶標。B細胞表位是抗原中可被 B細胞抗原受體或抗體特異性識別并結合的線性片段或空間構象結構。對 B細胞表位進行準確預測,不僅有助于腫瘤基礎免疫學研究,而且對腫瘤疫苗和抗體的研究與開發、診斷與治療均具有重要意義。本研究利用生物信息軟件系統及相關抗原性指數等,預測分析了 HER2/neu的二級結構及其 B細胞優勢表位,為 HER2/neu單克隆抗體的制備和基因工程疫苗的設計和研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 HER2/neu氨基酸序列:HER2/neu完整蛋白質的氨基酸序列檢索自 Swiss Prot蛋白質數據庫。

1.2 方法 HER2/neu二級結構預測:采用 EXPASY服務器提供的 SOPMA、GOR、HNN方法預測。HER2/neu跨膜區域預測:采用 EXPASY服務器提供的 SOSUI方法。HER2/neu親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數預測:采用EXPASY服務器提供的 Hopp＆ Woods、Zimmerman方法和DNAstar軟件的 Protean進行 Emini和 Jameson-Wolf分析。對上述方法預測的結果進行綜合分析,兼顧各預測參數推斷HER2/neu的 B細胞表位,并用吳玉章等[9]建立的抗原性指數綜合評判 HER2/neu的 B細胞優勢表位。

2 結果

2.1 HER2/neu的氨基酸序列 取自 Swiss Prot蛋白質數據庫(編號:P04626),共 1 255個氨基酸,相對分子質量 137 910 Da。

2.2 HER2/neu的二級結構預測 分別應用 EXPASY服務器上的 GOR、HNN、SOPMA方法預測 HER2/neu的二級結構。選取標準:3種方案中,取至少有兩個方案預測結果一致的重疊區為準。無規則卷曲主要位于 N端的 16～22,26～40,55～70,117～137,157～165,186～215,220～251,258～270,274～288,298～302,305～310,315～321,324～339,377～394,414～421,446～451,497～504,509～539,556～572,579～584,590～595,599～613,617～652,696～707,727～731,741～747,756～764,813～819,854～858,900～904,918～927,938～947,962～967,991～1 001,1 010～1 015,1 026～1 042,1 046～1 059,1 062～1 084,1 087～1 180,1 187～1 219,1 223～1 255區段,它們可維持HER2/neu分子結構的穩定。HER2/neu二級結構中柔性區域以無規則卷曲為主,少見 β-轉角。用 Kruskal-Wallis H Test檢驗 3種方法預測對 HER2/neu二級結構中的 α-螺旋、β-片層、無規則卷曲和 β-轉角的構成比的差別,結果表明 3種方法對 HER2/neu二級結構的預測分析結果間差異無統計學意義 (P=0.995,見表 1)。

2.3 HER2/neu跨膜區域預測 經 SOSUI方法分析,HER2/neu為具有 2次跨膜螺旋的膜蛋白,分別為 1～23,652～674區段,膜外區域位于 N端 24～651區段,膜內區域位于 N端675～1 255(見表 2,圖 1)。

表 1 GOR4、HNN、SOPMA 3種方法預測 HER2/neu二級結構的構成比 〔n(%)〕Table 1 Constitution ratio of HER2/neu secondary structure predicted by GOR4,HNN and SOPMA

表 2 SOSUI方法預測 HER2/neu跨膜區域Table 2 Transmembrane structure of HER2/neu predicted by SOSUI

圖 1 SOSUI方法預測 HER2/neu跨膜區域Figur e 1 Transmembrane structure of HER2/neu predicted by SOSUI

2.4 HER2/neu蛋白的親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數預測 綜合各參數分析 HER2的 B細胞表位所在的優勢區段:30～38,117～124,186～195,224～237,245～251,281～288,324～339,380～388,456～465,497～504,601～606,617～623,633～652,939～943,992～997,1 049～1 057,1 106～1 116,1 121～1 126,1 140～1158,1 166～1 175,1 225～1 234,1 240～1 246(見圖 2、表 3)。

圖 2 各種不同參數對 HER2/neu的預測結果Figure 2 Prediction of HER2/neu with various parameters

表 3 不同方法預測 HER2/neu二級結構區域結果Table 3 Epitopes predicted by various methods

2.5 HER2/neu抗原表位的綜合分析 綜合以上預測結果,根據吳玉章等[10]的抗原性指數計算方法,計算 HER2/neu可能的 B細胞表位區段平均抗原性指數,結果顯示 HER2/neu N端:497～504,939～943,1 106～1 116,1 140～1 158,1 166～1 175,1 225～1 234,1 240～1 246區段的抗原性指數相對較高 (見表 4),可能為 HER2/neu腫瘤抗原的優勢 B細胞表位。

表 4 HER2/neu的 B細胞表位優勢區域的平均抗原性指數Table 4 Average antigenicity index of epitopes

3 討論

在免疫應答過程中,B細胞表位供 B細胞受體 (BCR)識別誘導抗體應答,合理設計表位疫苗可以增強特異的保護性免疫反應的強度,避免常規抗原結構中可能出現的非必要的、抑制性表位的作用,以減少疫苗的不良反應。利用生物信息學的技術方法,對目的蛋白質的優勢抗原表位進行預測分析,可預先對表位疫苗進行設計以減少研究的盲目性。

B細胞表位在結構上可分為連續性的線性表位和不連續的空間構象表位。構象表位是蛋白質的二級或三級結構,不太穩定,在蛋白質受熱或酶解變性后會徹底破壞,不能恢復,分離和研究比較困難,因此目前大多數 B細胞表位預測方法是預測由連續的氨基酸殘基構成的線性 B細胞表位。

預測 B細胞表位主要的參數有二級結構、親水性、表面可及性、抗原性以及柔韌性等。雖然親水性和可及性是形成表位的首要條件,但決定表位是否具有抗原性尚需多種因素的參與,因而表位的形成是多種因素綜合作用的結果。蛋白質序列中肽鏈的局部可及性或柔韌性與相應部位的抗原性也密切相關。蛋白質的二級結構對抗原表位有很大影響。α-螺旋、β-折疊的化學鍵鍵能比較高,能夠較牢固地維持蛋白質的高級結構,但很難合適地與抗體嵌合,且經常處于蛋白質的內部,因而很少能成為抗原表位所在區域。而 β-轉角及無規則卷曲等柔性結構比較松散,易于發生扭曲、盤旋,并展示在蛋白質的表面,成為抗原表位的可能性較大。

吳玉章等[10]綜合考慮蛋白質的多種性質,如片段的活動性、結構、構象和氨基酸側鏈的排列等,建立了抗原性指數預測方法,用以篩選 B細胞優勢表位。發現 B細胞表位中 Leu、Thr、Pro、Asp、Asn、Glu、His、Lys、 Arg比一般蛋白質中常見 ;Gly、Ala、Val、Ile、Cys、 Met、Gln、Phe、 Tyr、Trp正相反,Ser則與一般蛋白質中的發現頻率相等。這種氨基酸組成上的差異可能與蛋白質的抗原性有關,親水性殘基更易出現在蛋白質表面,因此,某些氨基酸殘基在表位中出現的頻率更高,其抗原性指數就更大。

本研究通過對二級結構、跨膜區、親水性、表面可及性與抗原性等多種參數的綜合比較分析,預測了 HER2/neu可能的B細胞優勢表位,為該蛋白表位疫苗設計及單克隆抗體的制備等研究提供了理論依據。

1 Coussens L,Yang-Feng TL,Liao YC,et al.Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene[J].Science,1985,230:1132-1139.

2 Meric-Bernstam F,Hung MC.Advancesin targeting human epidermal growth factor receptor-2 signaling for cancer therapy[J].Clin Cancer Res,2006,12:6326-6330.

3 Slamon DJ,Clark GM,Wong SG,et al.Human breast cancer:correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene[J].Science,1987,235:177-182.

4 Barros-Silva JD,Leitao D,Afonso L,et al.Association of ERBB2 gene status with histopathological parameters and disease-specific survival in gastric carcinomapatients[J].Br JCancer,2009,100:487-493.

5 Ravdin PM,Chamness GC.The c-erbB-2 proto-oncogene as a prognostic and predictive marker in breast cancer:aparadigm for the development of other macromolecular markers— — a review[J].Gene,1995,159:19-27.

6 Gravalos C,Jimeno A.HER2 in gastric cancer:a new prognostic factor and a novel therapeutic target[J].Annals of Oncology,2008,19:1523-1529.

7 Vogel CL,Cobleigh MA,Tripathy D,et al.Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer[J].J Clin Oncol,2002,20:719-726.

8 Van Cutsem E,Kang Y,Chung H,et al.Efficacy resultsfrom the To GA trial:A phaseⅢstudy of trastuzumab added to standard chemotherapy(CT)in first-line human epidermal growth factor receptor 2(HER2)-positive advanced gastric cancer(GC)[J].J Clin Oncol,2009,27(18S):LBA4509.

9 吳玉章,朱錫華.一種病毒蛋白細胞表位預測方法的建立 [J].科學通報,1994,39:2275-2279.

10 吳玉章,朱錫華 .蛋白質抗原表位的研究 [J].科學,1994,(1):93.