絲素蛋白的相關生物學性能研究*

徐廣濤 林天送 周新妹 于海寧 徐國文 吳曉薇 鄭 漾 俞杭斌 陳士票

近幾年來，對蠶絲的應用研究已經從原來的紡織原料向醫藥、化妝品、食品和生化用品等領域延伸[1-3]。蠶絲柔軟、強韌、光滑又富有彈性，一直以來都是用作傳統的紡織材料，每年繅絲、織綢和服裝等企業產生大量蠶絲下腳料，這些下腳料未得到充分有效開發利用，不僅污染環境，也造成極大浪費。筆者利用蠶絲下腳料提取絲素蛋白，進行相關生物學性能研究，探討其綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑 電子天平sps202F型（常州稱重設備有限公司），分析天平AB204-N型（Mettler Toledo），紫外線分光光度計TU-1810（北京普析通用）。營養瓊脂培養基：牛肉膏 3 g，酵母膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 mL。PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 按文獻[4]方法將絲素蛋白人工配制成絲素肽、350 nm絲素粉、3 μm絲素粉、大分子質量絲素肽和納米絲素粉（<100 nm）。將上述絲素蛋白與50%二甲基亞砜液按體積比為1∶2.3混合，得到納米絲素蛋白顆粒的混合液或懸浮液，反復離心脫水完全除去其中有機溶劑并進行超聲處理，制成納米絲素蛋白液。

1.2.2 抑菌活性測定 （1）平板菌落計數法測菌落濃度。用3支1 mL無菌吸管分別精確地吸取10-5、10-6、10-7的稀釋菌液0.2 mL，置于無菌培養皿中，在對照板中加入同體積的無菌生理鹽水，后倒入熱熔后的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基約10～15 mL，迅速混勻，凝固后倒置于37℃溫室中培養。培養24 h后，觀察并取同一稀釋度2個平皿上的菌落平均數進行計算：每毫升中總活菌數=同一稀釋度2次重復的菌落平均數×稀釋倍數×5。（2）貼板法測樣品對霉菌的抑菌效果。用圓形玻璃管將長有霉菌的培養基取出，倒貼在含樣品培養基和對照培養基上。分別觀察48 h和72 h后的菌落生長狀況。（3）液體培養法測樣品對細菌的抑菌效果按文獻[5]方法進行。樣品溶液濃度為1.0 g/L，并采用等體積樣品處理，對照組用牛肉膏蛋白胨培養基。每個試驗組設試驗區2個（分別接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）。培養液37℃震蕩培養24 h，測定各種樣品在560 nm的吸光度值（A值），比較細菌生長情況。

1.2.3 抗紫外線活性的測定和研究 配制0.1%的各樣品溶液，在其未照射紫外線前進行200～400 nm的全波長掃描，得到各樣品的吸收光譜。1 h后分別在最大吸收波長處測定其吸光度和200～400 nm處的吸收光譜，比較得出各樣品吸收紫外線能力的變化。再分別配制1%和10%的各樣品溶液，同上進行200～400 nm全波長掃描。

1.2.4 吸濕性和保濕性的測定 用飽和碳酸鈣溶液保持相對濕度，將5種樣品分別置于密閉容器中，分別測量24 h和48 h后的質量（W1和W2），樣品原始質量為W0。24 h吸濕率(%)=（W1-W0）/W0×100%，48 h 吸濕率 (%)=（W2-W0）/W0×100%。將吸濕48 h后樣品（W2）置于干燥容器中，分別再測量24 h和48 h后的質量（W3和W4），計算24 h的保濕率(%)=［1-（W2－W3）/W2］×100%，48 h 保濕率(%)=［1-（W2－W4）/W2］×100%。

1.2.5 致敏性測定 將各樣品用50%二甲基亞砜溶解48 h，用蒸餾水稀釋得到0.5 g/L的絲素蛋白液。抽取皮膚無損傷、無皮膚病白色雌性豚鼠18只（嘉興學院醫學實驗中心），體質量（300±10）g。隨機分為A組、B組和C組，每組6只。實驗前24 h，對受試豚鼠進行脫毛處理，進行試驗。（1）致敏接觸：A組、B組和C組動物左側脫毛區分別涂以0.5 mL的絲素蛋白液、50%二甲基亞砜和1%2,4-二硝基氯苯（DNCB），給藥后用紗布和膠布固定，6 h后去除受試藥物，觀察0、24、48、72 h的過敏反應情況。第7天和第14天，用同樣方法各重復1次。（2）激發接觸：于末次給藥(第14天)時A組、B組和C組動物右側脫毛區分別涂以0.5 mL的絲素蛋白液、50%二甲基亞砜和1%DNCB。方法同上。（3）過敏反應平均分值和致敏率的計算。每只動物均按皮膚過敏反應評分標準評分，并計算各組的反應平均值，即反應平均值=（紅斑形成總分+水腫形成總分）/合計動物數。計算受試藥物的致敏率，即致敏率=出現皮膚過敏反應（無論程度輕重）陽性的動物數/受試動物總數。

2 結果

2.1 抑菌效果 平板菌落計數法結果表明金黃色葡萄球菌菌落數最多，枯草芽孢桿菌菌落數最少，見表1。絲素蛋白液對霉菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有顯著的抑菌效果。貼板法檢測表明，48 h后對照培養基、含絲素肽、350 nm絲素粉、3 μm絲素粉、大分子質量絲素肽和納米絲素粉樣品的培養基中菌落大小分別為10 cm×10 cm、1.5 cm×1.5 cm、2.2 cm×1.4 cm、1.9 cm×1.5 cm、2.0 cm×1.7 cm、1.8 cm×1.5 cm。除350 nm絲素粉對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制效果相似外，其余絲素蛋白樣品溶液對大腸桿菌的生長抑制效果優于對金黃色葡萄球菌的生長抑制效果，見表2。

表1 平板菌落計數法計算菌液

表2 液體培養法測定各樣品560 nm下的吸光度值

2.2 絲素蛋白吸收紫外線活性測定結果 0.1%未照射紫外線的5種絲素蛋白樣品對紫外線的最大吸收波長在200～230 nm。經紫外線照射1 h后，絲素肽、3 μm絲素粉、350 nm絲素粉吸收紫外線能力仍較強，見表3。1%和10%樣品溶液的吸光度為負值，以絲素肽為例，濃度較高的溶液所產生的抗紫外線能力并非較好，見圖1。納米絲素粉吸收波長廣，且經過10 min和20 min的紫外線照射后無明顯變化，在短時間的穩定性較好，見圖2、3。

表3 5種0.1%絲素蛋白液未照射紫外線時吸收波長和照射1 h后的吸光度

2.3 吸濕性和保濕性的測定結果 大分子質量絲素肽和絲素肽的吸濕能力較其他的樣品強，48 h吸濕率分別為44.78%和35.30%。就48 h保濕率而言，3 μm絲素粉和絲素肽更強，分別為82.29%和78.91%，見表 4。

2.4 絲素蛋白的致敏性測定 5種絲素蛋白樣品經豚鼠皮膚致敏接觸和激發接觸實驗，結果均為陰性，說明豚鼠皮膚對各絲素蛋白樣品均無過敏反應，以大分子質量絲素肽為例說明見表5。

3 討論

蠶絲蛋白包括絲素蛋白和絲膠蛋白2類。其中絲素蛋白與皮膚膠原蛋白同屬結構蛋白，研究表明它具有良好的生物親和性、無毒、無污染[6]。本研究結果表明，絲素蛋白液對霉菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有顯著的抑菌效果，且對大腸桿菌的生長抑制效果明顯優于對金黃色葡萄球菌的抑制效果。通過進一步的結構改進或者顆粒度研究，預計可以從中得到具有抗菌活性的新產品。

表4 各樣品的吸濕性與保濕性結果

表5 大分子質量絲素肽對豚鼠皮膚致敏實驗結果

經紫外線照射1 h后，絲素肽、3 μm絲素粉、350 nm絲素粉的紫外線吸收仍較強，說明它們的抗紫外線時間至少在1 h以上，表明絲素蛋白具有一定的紫外線防護作用，尤其以350 nm絲素粉的吸收范圍最廣。因為絲素蛋白中的色氨酸、酪氨酸屬芳香族氨基酸，具有吸收空氣中紫外線的功能[7]。

大分子質量絲素肽和絲素肽具有較好的吸濕能力，而3 μm絲素粉和絲素肽具有較好的保濕性，且對豚鼠皮膚均無致敏性反應，筆者認為可以用絲素蛋白進行更廣泛的醫藥研究。

[1]劉鳳云,黃先敏,戚俐,等.栗蠶繭絲蛋白的氨基酸組成與含量測定[J].蠶業科學,2008,34(3):548－551.

[2]Altman GH,Diaz F,Jakuba C,et al.Silk-based biomaterials[J].Biomaterials,2003,24(3):401－4l6.

[3]Motta A,Maniglio D,Migliaresi C,et al.Silk fibroin processing and thrombogenic responses[J].J Biomater Sci Polym Ed,2009,20(13):1875－1897.

[4]陳忠敏,郝雪菲,吳大洋,等.再生蠶絲絲素蛋白納米顆粒的制備及抗菌性[J].紡織學報,2008,29(7):17－20.

[5]于樹云,畢玲,葛庚芝.下呼吸道感染表皮葡萄球菌抗菌藥物敏感性分析[J].天津醫藥,2009,37(5):403－404.

[6]盛偉華,謝宇鋒,繆競誠,等.絲素蛋白材料對鼠胚表皮細胞毒性的實驗研究[J].蘇州大學學報(醫學版),2005,25(4):551－554.

[7]Perez-Rigeiro J,Viney C,Liorca J,et al.Mechanical properties of silkworm silk in liquid media[J].Polymer,2003,41(23):8433－8439.