測定直接膽紅素方法的分析

唐禮新 邱春紅

膽紅素是血紅素的代謝產(chǎn)物，主要在肝臟內(nèi)經(jīng)結(jié)合作用轉(zhuǎn)化排泄，它在血清中以未結(jié)合膽紅素（即游離膽紅素）、結(jié)合膽紅素（即單葡萄糖醛酸和雙葡萄糖醛酸膽紅素之和）及δ-膽紅素（清蛋白共價連接膽紅素） 3種形式存在。臨床上測定血清膽紅素是黃疸性疾病診斷與鑒別診斷的重要指標(biāo)，對了解疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有重要意義[1-3]。本文對Siemens Healthcare Diagnostics inc.生產(chǎn)的試劑盒進行評價和探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

Dimension RXL全自動生化分析儀。

1.2 試劑

試劑盒由Siemens Healthcare Diagnostics inc.生產(chǎn)；試劑Ⅰ成分：0.5%亞硝酸鈉、0.5mol/L鹽酸；試劑Ⅱ成分：0.45%對氨基苯磺酸、1.09%鹽酸。

1.3 原理

重氮化對氨基苯磺酸是通過亞硝酸鈉和對氨基苯磺酸在低pH的環(huán)境中結(jié)合而生成的。用0.05mol/L的HCL稀釋樣本。先記下空白讀數(shù)以消除非膽紅素色素的干擾。加入重氮化對氨基苯磺酸，結(jié)合的膽紅素會轉(zhuǎn)化成重氮基膽紅素。

1.4 方法

主要分析參數(shù)設(shè)置測定方法：主波長540nm，副波長700nm，樣品體積31μL，試劑體積R1為30μL，R2為60μL，讀取終點ΔA。試驗過程全部由Dimension RXL全自動生化分析儀完成。

2 結(jié) 果

2.1 精密度

按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）評價方案，取低、中、高3個不同濃度的DBIL樣品上、下午雙份測定，連續(xù)測20d，再每天測1次，共測20d，結(jié)果見表1。

表1 批內(nèi)和批間精密度測定結(jié)果（μmol/L）

2.2 線性和回歸分析[2]

按NCCLS的評價方案，選擇低濃度（31.4μmol/L）和高濃度（360.0μmol/L）的混合血清2份，然后把這2份樣品等量混勻產(chǎn)生中間值，再分別將中間值和低值、中間值和高值等量混勻，共產(chǎn)生5個不同值的樣品。在Dimension RXL全自動分析儀上用本法從低值到高值，然后從高值到低值測定，求得均值為Y，以理論值為X進行回歸分析，回歸方程為：Y=0.9914X+0.075，r=0.9998。結(jié)果表明DBIL在350μmol/L內(nèi)仍保持良好的相關(guān)性。

2.3 回收試驗

取1份DBIL含量為6.4μmol/L的血清0.8mL，加入DBIL含量為56.3μmol/L的血清0.2mL，計算濃度。結(jié)果測定濃度為16.32和16.98μmol/L，回收率為104.10%。

2.4 干擾試驗

2.4.1 血紅蛋白干擾試驗

取1份新鮮混合血清（DBIL為26.6μmol/L）分別加入不同濃度的血紅蛋白，用本法測定DBIL。結(jié)果血紅蛋白＜3.2g/L時，對測定結(jié)果無顯著干擾，但當(dāng)血紅蛋白濃度≥5g/L時，測定值出現(xiàn)負數(shù)，表明血紅蛋白濃度≥5g/L時，嚴重干擾DBIL的測定。

2.4.2 脂血干擾試驗

取1份新鮮混合血清（DBIL為26.6μmol/L）分別加入不同濃度的脂肪乳，用本法測定DBIL。結(jié)果三酰甘油＜8mmol/L時對測定結(jié)果無顯著干擾。

2.4.3 抗壞血酸干擾試驗

取1份新鮮混合血清（DBIL為6.6μmol/L）分別加入不同濃度的抗壞血酸，用本法測定DBIL。結(jié)果抗壞血酸＜1.5g/L時對測定結(jié)果無顯著干擾。

2.5 方法學(xué)比較

選擇含量在5～350μmol/L的臨床標(biāo)本80份測定DBIL，按NC-CLS（EP9-P）的評價方案作方法學(xué)比較，結(jié)果見表2。

表2 兩種方法測定DBIL的相關(guān)性比較

3 討 論

目前如何準(zhǔn)確可靠地測定血清膽紅素是大家一致關(guān)注的問題，由于膽紅素極易氧化，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品制備困難，即使各廠家試劑配方相同，但由于校準(zhǔn)液的問題，測定結(jié)果之間差異也較大。如果統(tǒng)一使用由Doumas等[4]提出的采用二牛磺酸膽紅素作為DBIL測定的校準(zhǔn)物，各種方法測定結(jié)果會得到很大改善，這與文獻報道相一致[5]。本研究使用的測定試劑，經(jīng)實驗證明其穩(wěn)定性好、抗干擾能力強，準(zhǔn)確度和精密度良好，測定線性滿足臨床要求，值得推廣應(yīng)用。

[1]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006:452.

[2]楊昌國,許葉,張抗.線性評價和干擾試驗中NCCLS評價方案的應(yīng)用[J].臨床檢驗雜志,1999,17(3):184.

[3]韓志鈞.臨床化學(xué)常用項目自動分析法[M].沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2005:1066.

[4]Doumas BT,Perry BW,Sasse EA,et al.Standardization in billirubin assays; Evaluations of selected methods and stability of bilirubin solutions[J].Clin Chem,1973,19(9):984-993.

[5]Young DS.Effects of Preanalytical Variables on Clinical Laboratory Tests[M].3rd ed. Washington,DC:AACC Press,2007:175.